РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об’єкт та умови дослідження
Дослідження проведені на 120 статево зрілих щурах-самцях масою 180-220 г.
Утримання, годування та евтаназію (шляхом декапітації) лабораторних тварин
проводили згідно із загальноприйнятими в експериментальній практиці методами
відповідно до міжнародних вимог щодо гуманного відношення до тварин [56].
Досліджувані параметри визначали у крові, гомогенатах і мітохондріях тканин
серця та печінки дослідних та контрольних тварин.
Експериментальний гіпотиреоз моделювали методом, запропонованим Е.С.Детюк та
співавторами, згідно з яким щурам впродовж 3-х тижнів щоденно перорально
вводили мерказоліл у дозі 3 мг на кг маси тіла тварини [52]. Мерказоліл є
синтетичним тиреостатичним препаратом, який аналогічно до інших антитиреоїдних
середників пригнічує синтез тироксину в щитоподібній залозі і знижує основний
обмін.
Функціональну активність ЩЗ оцінювали за вмістом тиреоїдних гормонів.
Концентрації тиреоїдних гормонів – Т3 та Т4, ТТГ у сироватці крові визначали
радіоімунологічним методом за допомогою набору IMMUNOTECH ка.: 1699, 3286. Для
визначення рівня тиреоглобуліну використовували метод радіоімунологічного
аналізу ’’in vitro” за допомогою набору білоруського виробництва, розробленого
співробітниками лабораторії хімії для ИБОХ НАИБ.
Окремим групам контрольних і дослідних тварин провадили інтервальне гіпоксичне
тренування у наступному режимі: п’ятиразове піднімання тварин у барокамері на
висоту 3000 м [75]. Умовне піднімання здійснювали поступово: перший день – на
висоту 1000м, другий – 2000м, і лише з третього дня - 3000м. Тривалість
гіпоксичної експозиції - 10 хв., перерви між сеансами гіпоксії – 15 хв.,
тривалість тренування – 10 днів, швидкість „піднімання” – 20 м/c [37].
2.2. Методи дослідження
2.2.1. Виділення мітохондрій тканин серця та печінки. Забір крові та тканин
проводився після забою тварин. Гомогенізацію органів проводили в охолодженому
фізіологічному розчині при розведенні 1:10. Попередньо тканини промивали
охолодженим фізіологічним розчином, подрібнювали і гомогенізували у
гомогенізаторі Поттера-Евельгейма при швидкості 200 об/хв.
Мітохондрії серця виділяли загальноприйнятим методом диференційного
центрифугування [250] в середовищі, яке містило: 250 ммоль сахарози, 2 ммоль
ЕДТА і 5 ммоль тріс-НCl буферу,
(рН = 7,4). Охолоджену протягом 10 хвилин у середовищі виділення тканину
подрібнювали, пропускали через спеціальний прес і гомогенізували в
гомогенізаторі Поттера-Евельгейма при 200 об./хв і десяти рухах тефлонового
товкачика. Перше центрифугування 10 % гомогенату для осадження фракції ядер і
не повністю зруйнованих клітин проводили при 3000 об./хв протягом 5 хв.
Мітохондріальну фракцію одержували центрифугуванням супернатанту протягом 10 хв
при 11000 об./хв. Мітохондрії печінки аналогічно виділяли методом
диференційного центрифугування з модифікаціями, максимально забезпечуючи їх
інтактність [79]. Після забору печінку зберігали в охолодженому середовищі
виділення, яке містило 250 ммоль сахарози і 10 моль тріс-буферу (рН = 7,4).
Тканину печінки подрібнювали в пресі та гомогенізували у гомогенізаторі
Поттера, як і міокард. З 10 % гомогенату тканини печінки центрифугуванням
осаджували фракцію ядер – 3 хв. при 1500 об./хв і 4 хв. при 2500 об./хв. без
зупинки центрифуги. Мітохондріальну фракцію отримували центрифугуванням
супернатанту 10 хв. при 6000 об./хв. Для центрифугування використовували
рефрижираторну центрифугу ЦЛР-1. Отриманий осад мітохондрій гомогенізували
вручну із середовищем виділення, яке додавали із розрахунку тканина:середовище
виділення – 10:1. Отриману суспензію зберігали на льоді і використовували для
наступних досліджень. Всі операції проводили при охолодженні до температури 0°
– 4° С. Розчини, а також інструменти і посуд, що використовували при виділенні,
попередньо охолоджувалися. Вміст білка в суспензіях мітохондрій визначали за
методом Лоурі [286].
2.2.2. Методи дослідження органоспецифічних ферментів та системи
холестеринового забезпечення. У крові тварин контрольної та дослідної груп
визначали вміст загального ХС, ХС ліпопротеїнів (ЛП) різної щільності,
тригліцеридів, а також активність АлТ, АсТ, КК – маркерних органоспецифічних
ензимів тканин міокарда та печінки. Всі вище перелічені параметри визначали на
біохімічному аналізаторі Biosystems BTS-370 Plus з використанням реактивів
фірми „Biosystems”.
2.2.3. Методи дослідження пероксидного окиснення ліпідів та системи
антиоксидного захисту. Рівень ПОЛ у сироватці крові, гомогенатах і мітохондріях
печінки та серця оцінювали за вмістом первинних продуктів цього процесу –
дієнових кон’югатів і за нагромадженням одного з вторинних продуктів – МДА за
реакцією з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-АП).
Вміст ДК визначали за методом Плацера в модифікації Гаврилова В.Б., Мішкорудної
М.І., 1983 [39]. Принцип методу полягає в екстрагуванні ліпідів за допомогою
суміші гептан-ізопропанол (1:1) з наступним визначенням оптичної густини
гептанового шару при довжині хвилі 233 нм, який відповідає максимуму поглинання
вуглеводневих ланцюгів з кон’югованими (спряженими) подвійними зв’язками, які
утворюються внаслідок внутрішньомолекулярного перегрупування на початковому
етапі ПОЛ. Використання коефіцієнтів молярної екстинкції окремих ліпідів у
даному випадку утруднене через складність і мінливість ліпідного складу
біологічного матеріалу, тому результати виражали в одиницях оптичної густини в
перерахунку на мл чи г досліджуваного середовища.
Вміст МДА визначали за методом Тімірбулатова Р.А., Селє
- Київ+380960830922