РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт досліджень. Виділення лімфоцитів
Моноядерні лімфоцити периферичної крові людини виділяли з гепаринізованої
свіжоотриманої крові практично здорових донорів віком 21-28 років, розведеної
розчином Хенкса без Са2+ і Мg2+ у 3 рази (480 зразків). У пробірки 15x100 мм
наливали по 3 мл розчину фікол-урографіну (с= 1,077 г/см3). За допомогою шприца
з довгою голкою, кров (8 мл) нашаровували на ступеневий градієнт 9% фіколу в
урографіні, після чого центрифугували 30 хв при 200 g. На межі розділу двох фаз
збирали прошарок лімфоцитів.
Для вивчення ферментативної активності лімфоцитарну суміш центрифугували 30 хв
при 800 g та відбирали надосадову рідину, а лімфоцити ресуспендували у
відповідній кількості 0,9 % NaCl, що містив ЕДТА у кінцевій концентрації 0,1
%.
Підраховували клітини у камері Горяєва, використовуючи як барвник 0,1%
трипановий синій. Життєздатність лімфоцитів, яка в усіх дослідах складала не
менше 95%, оцінювали за забарвленням трипановим синім [6, 162].
Обрані для досліджень моноядерні лімфоцити периферичної крові людини
характеризуються низкою переваг, а саме: розмірами цих клітин (7-8 мкм),
кількістю, зручністю виділення. У роботі використані методи, які, на нашу
думку, дозволяють адекватно дослідити системи глутатіонового антиоксидантного
захисту та активного транспорту катіонів у цих клітинах.
2.2. Пермеабілізація клітин
Для розкриття глутатіонредуктазної, глутатіонтрансферазної та Nа+,К+-АТФазної
латентної активностей до суспензії лімфоцитів додавали 0,2 % сапонін, а для
визначення глутатіонпероксидазної та Са2+,Мg2+-АТФазної активностей - 0,1%
сапонін. Дана методика грунтується на роботах, виконаних на еритроцитах,
лімфоцитах і сперматозоїдах [65, 66].
2.3. Визначення глутатіонпероксидазної активності
Суть методу полягає у розвитку кольорової реакції з
5,5-дитіо-біс(2-нітро)-бензойною кислотою (ДТНБК) з утворенням кольорового
продукту тіонітрофенільного аніону (ТНФА), кількість якого прямо пропорційна
кількості SН-груп, які прореагували з ДТНБК [24, 63, 175].
Для визначення глутатіонпероксидазної активності 0,1 мл суспензії лімфоцитів
вносили в 0,8 мл інкубаційного середовища, яке готували на 0,1 М трис-НСІ
буфері (рН 8,0) та містило 2 мМ ЕДТА, 12 мМ NaN3, 4,8 мМ GSН. Після 10 хв
інкубації при 37°С додавали 100 мкл 20 мМ гідропероксиду третбутилу та
інкубували ще 30 хв. Реакцію зупиняли додаванням 0,2 мл 20% ТХО охолодженої.
Потім проби центрифугували 10 хв при 800 g. До 50 мкл супернатанту додавали 5
мл ОД М трис-НСІ буферу, 50 мкл реактиву Елмана. У контрольні зразки 0,1 мл
гемолізату додавали після ТХО. Через 5 хв визначали оптичну густину проб на
спектрофотометрі СФ-46 при 412 нм в 1 см кюветі проти Н2О.
ГП-у активність відображали в нмоль GSН/мг білка за 1 хв, враховуючи молярний
коефіцієнт екстинції тіонітрофенільного аніону (ТНФА) = 13,6 М-1Чсм-1.
2.4. Визначення глутатіонредуктазної активності
Глутатіонредуктазну активність суспензії лімфоцитів визначали
спектрофотометрично при l=340 нм в 0,2 М калій-фосфатному буфері (рН 7,0), який
містив 2 мкМ ЕDТА. На 1 мл об'єму кювети вносили 0,5 мл калій-фосфатного буферу
при 30°С; 50 мкл 2 мкМ NADPH, приготовленого на 10 мкМ трис-НCl буфері (рН
7,0); 50 мкл 20 мкМ GSSG. До кінцевого об'єму доводили дистильованою водою.
Реакцію починали додаванням до кювети 100 мкл суспензії клітин. Час інкубації
становив 10 хв. Визначення проводились по зміні поглинання при 340 нм, 30 С°.
Як контроль використовували проби без NADPH, без GSSG та без субстрату. ГР-у
активність відображали в нмоль NADPH/мг білка за 1 хв, враховуючи молярний
коефіцієнт екстинції NADPH = 6,22Ч103 М-1Чсм-1 [17, 175].
2.5. Визначення глутатіонтрансферазної активності
Глутатіонтрансферазну активність лімфоцитів визначали спектрофотометрично при l
= 340 нм в 0,1 М калій-фосфатному буфері (рН 6,5), що містив 1 мМ ЭДТА, 1 мМ
1-хлор-2,4-динітробензол, 5 мМ GSН. Суспензію клітин додавали до концентрації
0,4 мг білка на 1 мл реакційного середовища. ГТ-у активність розраховували на 1
мг білка та відображали в нмоль GSН/мг білка за 1 хв [17, 25], враховуючи
молярний коефіцієнт екстинції 1-хлор-2,4-динітробензолу = 9,6 Ч103 М-1Чсм-1.
2.6. Оцінка стану пероксидації ліпідів за визначенням концентрації малонового
діальдегіду
Принцип методу визначення МДА полягає у тому, що при високій температурі у
кислому середовищі він реагує з 2-тіобарбітуровою кислотою, створюючи
забарвлений триметиленовий комплекс з максимумом поглинання при 532 нм [85].
Для визначення кількісного вмісту МДА до 0,2 мл суспензії клітин додавали 3,0
мл дистильованої води, 0,5 мл КMnO4 перемішуючи суміш за допомогою скляної
палички. Через 10 хв, додавали 0,5 мл FeSO4, цю процедуру повторювали 2 рази.
Пробірки закривали гумовими корками з фольгою. Через 5 хв реакцію зупиняли
додаванням 1 мл 20% розчину ТХО.
Після центрифугування протягом 15 хв при 200 g надосадкову рідину по 2 мл
переносили у пробірки, додавали по 0,5 мл розчину НCl, 1 мл 0,8% розчину
тіобарбітурової кислоти і поміщали на 20 хв в киплячу водяну баню. Як контроль
використовували проби, що містили 2 мл дистильованої води.
Після появи рожевого забарвлення, проби охолоджували до кімнатної температури,
додавали 3 мл бутанолу і центрифугували 15 хв при 800 g.
Оптичну густину вимірювали при 532 нм проти контрольної проби. Розрахунок
вмісту МДА проводили, використовуючи коефіцієнт молярної екстинції 1,56 Ч105
М-1Чсм-1 [85].
2.7. Визначення Ca2+,Mg2+-АТФазної активності
Визначення Ca2+,Mg2+-АТФазної активності проводили при 37° С у середовищі (1
мл), що міс
- Київ+380960830922