РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Робота виконувалась у проблемній лабораторії, і на кафедрі мікробіології та технології переробки Вінницького державного аграрного університету, на землях реформованих агроформувань і радіологічно-контрольних майданчиках Вінницької області. Дослідження проведені впродовж 2003 - 2007 років згідно із загальною схемою експериментальних досліджень (рис. 2.1).
Інформаційна база дослідження. Інформаційною базою дослідження були нормативно-правові акти: законодавчі акти Верховної Ради України, Укази Президента України, постанови Кабінету Міністрів України, офіційні статистичні матеріали Державного комітету статистики України, Вінницького обласного управління статистики та Національна доповідь Державного управління охорони навколишнього природного середовища у Вінницькій області за 2000-2006 роки [284 - 291].
У роботі використовували наступні тест-штами мікроорганізмів: Mycobacterium bovis-8, Mycobacterium bovis (БЦЖ) - збудник туберкульозу великої рогатої худоби та Міcobacterium tuberculosis Н37 RV - збудник туберкульозу людей, Mycobacterium tuberculosis - клінічний штам, резистентний до всіх протитуберкульозних препаратів, Mycobacterium tuberculosis - клінічний штам, чутливий до всіх протитуберкульозних препаратів. Як супутню мікрофлору використовували тест-культури: кишкової палички (Е. соІі - К 12), сінної палички (В. subtilis) та епідермального стафілококу (S. epidermitidis -1225).
Відбір проб грунту. Проби грунту відбирались відповідно до ДСТУ 4287:2004 ?292?. Досліджували грунт з контрольно-радіологічних майданчиків, вигульних майданчиків корів приватного господарства, земля з коренеплодів, зшкребок з годівниць тварин. На кожному контрольно-радіологічному майданчику, виділяли ділянку площею 25 м2, з якої відбирали 10 об'єднаних проб.
Рис. 2.1. Схема проведення досліджень
Кожну з них формували із 3-5 проб вагою 200-250 г, взятих пошарово з глибини 0-5 і 5-20 см по діагоналі. Грунтові проби відбирали у стерильні пакети. Для відбору грунту використовували стерильні металеві совки. Кожен зразок супроводжувався етикеткою, на якій вказувалась дата взяття проби, район ділянки і горизонт. Перед узяттям проби, стерильним шпателем знімали верхній шар грунту, товщиною 1,5-2,0 см. Із окремих проб робили середній зразок масою не менше 1 кг, з якого відбирали кінцеву пробу 300 г. Зразки грунту пакували у стерильні пергаментні пакети і відразу ж доставляли в лабораторію, де зберігали в холодильнику при температурі 4-5 0С не більше 12 год. У лабораторії пробу розподіляли на стерильній поверхні (скло), видаляли домішки, потім розтирали у стерильній ступці і просівали через стерильне сито з діаметром вічок 3 мм. Після ретельного перемішування, відважували 30г грунту, переносили в колби, заливали 80-100 мл дистильованої води, ставили в шутель-апарат і струшували протягом 15 хв. Проби з годівниць відбирали з площі 100 см2 ?293?.
Метод обробки і збагачення проб матеріалу. Для виявлення мікобактерій в грунті, гної і інших об'єктах зовнішнього середовища проби збагачували (концентрували) такими методами:
1. Методом флотації. Проби поміщали в колби, заливали 80-100 мл дистильованої води, ставили в шутель-апарат, струшували протягом 15 хв, після чого рідину фільтрували в чисту колбу об'ємом 250 мл (шийка колби діаметром 1-1,5 см) і до фільтрату додовали 0,5 мл ксилолу. Вміст знову струшували 10 хвилин, після чого доливали дистильовану воду до повного об'єму - 250,0 мл. Через 60 хвилин крапельки ксилолу спливали на поверхню, захоплюючи мікобактерії і концентруючи їх у невеликому об'ємі утвореного на поверхні кільця. Флотаційне кільце піпеткою переносили на предметне скельце, робили 8 препаратів-мазків, які фарбували за Ціль-Нельсоном і в подальшому мікроскопували [258, 294].
2. Обробка проб стимулятором росту ВКГ. У стерильну колбу на 100 мл вносили 50 мл стерильної води й 20 г стерильного нативного гною і культури мікобактерій. Концентрація клітин мікобактерій становила 1000 мікробних тіл в 1 мілілітрі. Приготовлену суспензію розділяли на дві частини. Одну з них зберігали при +22-26 ?С, а другу поміщали в холодильник при + 4?С протягом 120 дібна.
Після чого, суспензію обробляли стимулятором росту ВКГ протягом 24 год, висівали на середовище ВКГ і термостатували за загально-прийнятою методикою (протягом 45 діб). З отриманих культур готували мазки та фарбували за Ціль-Нільсоном. ?295?.
3. Метод А.П. Алікаєвої. Для знищення супутньої мікрофлори обробляли патологічний матеріал сірчаною кислотою. Цей метод зручний для обробки матеріалу в день його відібору ?296?. Матеріал об'ємом до 0,5 см3 поміщали у банку зі скляними кульками або битим склом, додаючи стільки ж 10% розчину сірчаної кислоти і старанно, протягом 10 хвилин розтирали. Оброблений кислотою матеріал 10 хвилин центрифугують. Час контакту матеріалу з кислотою не повинен перевищувати 20 хвилин від початку обробки. Після центрифугування надосадну рідину зливають, до осаду додають фізіологічний розчин, ще раз центрифугують і зливають, відмиваючи кислоту. Осад, по 0,2 мл суспензії, засівали на середовище Лєвенштейна-Йєнсена. Решту суспензії (0,9 - 1 мл) переносили у стерильні пробірки з 1 мл стимулятором росту, яку, після 24 годин експозиції в термостаті при 37 °С, висівали (1 мл) на поверхню середовища ВКГ. Фарбували мазки із отриманих культур фуксином.
Світлова мікроскопія. Препарати-мазки фарбують за Ціль-Нільсоном і продивлялись в 300 полів зору мікроскопу. Для мікроскопії використовували бінокулярний мікроскоп (МИКМЕД-1), а для комп'ютерної мікроскопії - мікроскоп типу МБР-1, відеокамеру Quik Cam Home фірми Philips, персональний комп'ютер Pentium з мінімальною конфігурацією.
Ми також використовували метод мікрокультивування мікобактерій на скельцях за Прайсом. З отриманої культури готували суспензію, тобто в чашку Петрі з культур