РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В основу работы положены результаты обследования 87 детей с ВИЧ-инфекцией в
возрасте от 1 года до 13 лет включительно.
Комплексность изучаемой проблемы апоптоза при ВИЧ/СПИДе у детей определила
необходимость использования таких методов исследования: клинического,
лабораторных, инструментальных, а также проведения специальных исследований –
иммунологических, вирусологических, и консультации узких специалистов.
Материалом для иммунологических и вирусологических методов исследования во всех
случаях служила кровь, взятая из локтевой вены, согласно стандартной процедуре
с соблюдением соответствующих мер предосторожности. Для исследования
показателей иммунного статуса и определения вирусной нагрузки использовали
кровь с добавлением антикоагулянта цитрата натрия. Для исследования
показателей, определяемых методом иммуноферментного анализа, использовали
сыворотку крови, которая до проведения исследования хранили в одноразовых
пробирках типа "Эппендорф" в холодильнике в замороженном виде при T=-18°C.
2.1. Определение факторов клеточного звена иммунитета в крови детей
Исследование клеточного звена иммунитета проводили путем определения
абсолютного и относительного количества субпопуляций лимфоцитов, несущих на
своей поверхности следующие рецепторы: CD4, CD8, CD16, CD25, CD56, CD95. Для
выявления CD маркеров использовали метод постановки непрямой реакции
поверхностной иммунофлюоресценции (РИФ) с набором моноклональных и
поликлональных антител, предназначенных для количественного определения
субпопуляций лимфоцитов в сыворотке крови методом иммунофлуоресценции «Статус»
(производитель – ООО «Сорбент» г. Подольск, Московская обл.).
Определяли следующие субпопуляции лимфоцитов: CD4+ (T-клетки, выполняющие
хелперно-индукторные функции), CD8+ (T-клетки, обладающие супрессорной и
цитотоксической функцией), CD16+ (NK-клетки), СD25 (рецептор к интерлейкину-2,
рецепторнесущие активированные лимфоциты), CD95 (Fas-рецептор).
Принцип метода заключается в том, что к выделенным из крови лимфоцитам
добавляют моноклональные антитела и взвесь инкубируют при T=4°C. К полученному
путем центрифугирования осадку клеток, добавляют 50 мкл F(ab’)2-фрагментов
овечьих антител к Ig мыши, меченных ФИТЦ и разведенных 1:100. После отмывки и
окраски фиксированных лимфоцитов проводят их анализ на проточном цитометре.
Результат подсчитывают в процентном соотношении. Абсолютное число СD выражали в
х 106/л относительное ? процентах (%).
Соотношение абсолютного содержания СD4+/СD8+ определяло иммунорегуляторный
индекс.
2.2. Определение маркеров апоптоза в сыворотке крови
Для определения интенсивности апоптоза клеток разработаны различные методы.
Наиболее распространенными являются методы определения: уровня экспрессии
Fas-рецептора (CD95), содержания белка p53, содержания антител к белку Анексина
V.
Определение уровня экспрессии рецептора СD95 осуществлялось по методике, общей
для определения различных рецепторов CD, описанной выше.
Для количественного измерения p53 в сыворотке крови детей использовали р53
ELISA kit твердо-фазовый энзимно-связанный иммуносорбентный набор, основанный
на принципе "сэндвича"; микротитрационные лунки, покрытые специфическими
антителами к р53, в которые добавляются образцы, стандарты с известным и
неизвестным количеством р53.
Во время первой инкубации антиген р53 добавлялся в лунки, после промывания
биотиноловое моноклональное антитело, специфическое к р53, инкубировалось.
Затем добавлялся энзим (стрептавидин-пероксидаза), а после инкубации и
повторного промывания с целью удаления несвязанных частиц из образца, вновь
добавлялся раствор субстрата. Вступая в реакцию со связанным энзимом, субстрат
вызывает окрашивание смеси, интенсивность которого прямо пропорциональна
концентрации р53 в образце. Фотометрирование лунок проводили на
спектрофотометре Stat-Fax-2100 (США) при длине волны 450 Нм.
Далее, с учетом значений оптической плотности контрольных проб, проводили
математическую обработку результатов анализа. Для перевода полученных
результатов в единицах ОП измерения в ЕД/мл, строили калибровочную кривую
представленную на рис. 2.1.
Рис. 2.1. Калибровочная кривая для определения содержания p53.
Оптическая плотность оценивалась по формуле:
ОП критическая = ОПК контроля отрицат. ± 10% (N: 53=0.024±0,002 ОП);
С целью определения показателей анти-Аннексина V IgG/M использовали метод
ИФА(ELISA), выполняемый методом двойного связывания. Принцип метода состоит в
том, что первая реакция происходит между определяемым Ig и очищенным антигеном
возбудителя и оценивается фиксацией комплекса антиген-антитело к поверхности
лунок иммунологического планшета. После завершения первой реакции планшет
отмывается. При этом несвязавшиеся компоненты исследуемой пробы удалялись, а на
стенках лунок оставались только комплекс антиген-антитело.
Для выявления образовавшихся иммунных комплексов проводили вторую
иммунологичесую реакцию, в которой в качестве антигена выступал связавшийся
специфический Ig, а в качестве антител к нему — конъюгат
стрептавидин-пероксидазы. После завершения второй иммунологической реакции
вновь проводилось отмывание лунок планшета от избытка коньюгата.
Далее осуществляли третий этап процесса – ферментативную реакцию, в ходе
которой образовываллось окрашенное вещество. Интенсивность окраски в лунке
зависела от количества содержащихся в пробе Ig.
Для количественного определения анти-Анексина V IgG/IgM использовали
иммуноферментный набор Annexin V ELISA kit (катего
- Київ+380960830922