Розділ 2
Матеріал і методи досліджень
2.1. Досліди на лабораторних тваринах
Мета досліджень – провести пошукові експерименти з вивчення питання про вплив
нітратів на організм білих щурів при хронічному нітратно-нітритному токсикозі.
Досліди проведено в період 1995-2003 рр. на тваринах віварію ЛНАВМ.
Для досліду використовували нелінійних білих щурів, самців і самок, масою тіла
200-220 г. Щурів утримували у групових клітках у кількості, залежно від умов
досліду. Годівлю тварин проводили комбікормом, хлібом і зерном вівса. Напування
було вільним з напувалок.
Для дослідження використано 186 щурів. Моделями токсичного ураження тварин
слугувала експериментальна інтоксикація їх нітратом натрію, який задавали з
кормом у субтоксичних дозах (рис. 3.1).
Нітрат натрію в дозі, розрахованій на живу масу групи тварин у досліді,
розчиняли у мінімальній кількості питної води (щоб препарат повністю
розчинився). Таким розчином зволожували корм і ретельно його перемішували та
згодовували щурам. Кількість корму була такою, щоб тварини його повністю
поїдали упродовж доби. Кожного ранку корм із нітратом натрію поновлювали.
Комбіновану токсичну дію нітратів і нітритів на морфологічні та біохі-мічні
показники крові щурів вивчали за схемою, представленою на рис. 3.1. Для
дослідів було використано 24 щурі, яких підбирали за принципом аналогів, по 6
тварин у групі.
Щурі першої групи були контрольними. Упродовж 30-и діб їм згодовували корм, у
якому рівень нітратів був у допустимих межах – 3-5 мг/кг (нітрити відсутні).
Щурам другої групи упродовж 30-и діб згодовували такий самий корм із додаванням
нітрату натрію в дозі 100 мг NO3Ї/кг маси тіла. Щурам третьої групи до корму
додавали 1 мг/кг нітриту натрію. Щурам четвертої групи додатково до корму
додавали 100 мг/кг нітрату натрію та 1 мг/кг нітриту натрію.
На 30-у добу досліду щурів піддавали евтанзії при слабкому ефірному наркозі та
відбирали кров для дослідження морфологічних і біохімічних показників.
Метгемоглобін
Гемоглобін
Еритроцити
Об’єм еритроцитів
Вміст гемоглобіну в
еритроциті
Величина еритроцита
Кольоровий показник
Нітрати
Нітрити
Лейкоцити
Моноцити
Лімфоцити
Гранулоцити
Еозинофіли
Базофіли
Рис. 3.1 Схема вивчення токсичної дії нітратів і нітритів на організм щурів
Вивчення дезінтоксикаційної функції печінки (рис. 3.2) проводили при
пероральному введенні щурам нітрату натрію в дозі 0,1 г/кг м.т. (1/5 ЛД50) та
0,5 г/кг м.т. (1/2 ЛД50).
На 30-у добу дослідження у сироватці крові визначали показники, які
відображають стан дезінтоксикаційної функції печінки: рівень загальних ліпідів,
загального та вільного холестеролу, триацилгліцеролів і сечовини.
Додатковим тестом визначення стану дезінтоксикаційної функції печінки була
гексеналова проба. Щурам одноразово перорально задавали нітрат натрію в дозі
0,5 г/кг (1/2 ЛД50). Через 1, 3, 5 і 24 години, щоб викликати сон, щурам
внутрішньочеревно вводили гексенал (60 мг/кг) у формі 1% розчину. Як контроль
були використані щурі, яким нітрат натрію не давали, у них досліджували лише
тривалість гексеналового сну. Його початок визначали за часом прийняття
бокового положення, а пробудження – спробою тварини підвестися.
- рівень загальних ліпідів
- вміст загального і вільного
холестеролу
- вміст триацилгліцеролів
- вміст сечовини
Рис. 3.2 Схема вивчення дезінтоксикаційної функції печінки
Мутагенну дію нітратів оцінювали за метафазним аналізом клітин кісткового мозку
та кількістю мікроядерних еритроцитів у периферичній крові дослідних щурів
після введення нітриту натрію за методом W.Schmid [389]. В основі методу оцінки
мутагенної дії нітритів лежить підрахунок видимих структурних порушень хромосом
у клітинах на стадії метафази. Критерієм цитогенетичної дії нітриту натрію була
кількість спонтанних хромосомних розладів, тобто наявність аберацій
хромосомного і хрома-тидного типів при гострому та хронічному токсикозі.
Схеми вивчення мутагенної дії нітритів у гострому досліді представлено на рис.
3.3 і при хронічному токсикозі на рис. 3.4.
Досліди проведені на 54 нелінійних білих щурах. Їх розділили на 6 груп по 9
тварин у кожній. Щурі першої групи були контрольними. За допомогою металевого
зонда їм перорально вводили по 0,5 мл води. Щурам 2-ї групи одноразово
перорально вводили нітрит натрію в дозі 0,02 г/кг, що складає 1/5 ЛД50. Щурі
третьої групи перорально отримували 1/2 ЛД50 нітриту натрію (0,05 г/кг).
Рис. 3.3 Схема вивчення мутагенної дії нітритів у гострому досліді
Через 24, 48 і 72 години після введення нітриту натрію з кожної групи забивали
по 3 щурі. За 2 години перед забоєм піддослідним тваринам підшкірно вводили
0,04% розчин колхіцину в дозі 0,01 мл/г маси їх тіла. Щурів декапітували при
легкому ефірному наркозі та відбирали кров і кістковий мозок для досліджень.
Із стегнової кістки зрізали епіфіз. За допомогою шприца, наповненого підігрітим
до температури 37-39єС 0,075 М розчином калію хлориду, вимивали кістковий мозок
у центрифужну пробірку, яку на 10 хвилин поміщали у термостат для гіпотонічної
обробки. Відтак суспензію клітин центрифугували 5 хв при 100 об/хв, а
надосадову рідину обережно видаляли. До осаду наливали фіксатор – суміш
етилового спирту та оцтової кислоти у співвідношенні 3:1. Після 3-разової
заміни фіксатора готували препарат хромосом. На предметне скло наносили
суспензію клітин, фіксатор випаровували над полум’ям спиртівки, а хромосоми
фарбували азур-еозином.
Оцінку мутагенної дії нітриту натрію проводили за допомогою мікроскопа з
об’єктивом