РОЗДІЛ 2. ОБ'ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Методи роботи з одноклітинними об'єктами
У експериментах з вивчення гормезисної дії іонізуючої радіації і дослідження структури перехідного процесу, що індукується опроміненням, одним з об'єктом дії була кишкова паличка Escherichia coli JM 101, штам якої був люб'язно наданий співробітниками Інституту молекулярної біології і генетики НАН України. Бактерії вирощували на агаризованому пептонному бульйоні (середовище LB). У дослідах використовували водні змиви 24-годинної культури. Швидкість бактерійного росту оцінювали шляхом визначення оптичної щільності бактерійних суспензій [255] за допомогою фотоелектроколориметра ФЕК-56. Калібрувальна крива була отримана методом макроколоній при посіві бактерійної суспензії на агаризоване 1,5 %-не живильне середовище. З цією метою суспензії бактерій доводили до концентрації 5,0Ч103 клітин/мл, висівали на агаризоване живильне середовище в чашки Петрі, витримували їх 24 год при температурі 370С, після чого підраховували кількість макроколоній, що виросли.
Для оцінки дії гострого гамма-випромінювання на бактерії водну суспензію 24-годинної культури бактерій (109 клітин/мл) опромінювали на кобальтовій (60Со) установці "ИССЛЕДОВАТЕЛЬ" Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України в діапазоні доз від 0,63 до 100 Гр при потужності дози 4,0 сГр/с. Виживаність опромінених бактерій оцінювали методом макроколоній. Статистичну обробку результатів проводили при рівні значимості р ? 0,05 за критерієм Стьюдента [119].
Для визначення меж модифікації реакцій взаємодіючих клітин на опромінення і визначення внеску міжклітинних взаємодій у відновлення клітин від радіаційних пошкоджень, а також вивчення впливу міжклітинних взаємодій в умовах, які безпосередньо впливали б на радіобіологічні реакції клітин, використовували трихомну (нитчасту) водорость Anabaena cylindrica, культура якої була люб'язно надана співробітниками Інституту гідробіології НАН України. Популяція водорості є сукупністю багатоклітинних ниток різної довжини. Кожна клітина такої нитки взаємодіє за допомогою плазмодесм з найближчими і віддаленими сусідніми клітками, відчуваючи на собі, таким чином, вплив цілої нитки. Ймовірно, що ступінь міжклітинної взаємодії (фізичної, метаболічної тощо.) корелюватиме із ступенем геометричної зв'язності клітин в трихомі. У якості міри зв'язності клітин було прийнято середнє число контактів однієї клітки в нитці даної довжини [252].
Для нитчастих клітинних структур ступінь зв'язності клітин в нитці (Ст) визначали по формулі:
Ст = 2 (п - 1)/п,
де п - число клітин в нитці.
Тижнева культура Anabaena cylindrica, вирощену на середовищі Дрью [331], була розмацерована шляхом 10 хвилинного встряхування на качалці на короткі фрагменти, опромінена в дозі 4000 Гр при потужності 0,08 Гр/с і висіяна на непоживний агар. Через добу після опромінення під мікроскопом проглядали нитки, фіксуючи в них інтерфазно (метаболічно) загиблі клітки (що виглядали знебарвленими), розраховували частку клітин, що виживала і розподіляли її залежно від довжини нитки, до складу якої вони входили.
2.2. Використання методів математичного планування експерименту
Окрім комплексу стандартних методів графічною, математичною і статистичної обробки отриманих даних, застосували один з методів математичного планування експерименту (МПЕ), а саме метод повного факторного експерименту (ПФЕ).
Основи теорії МПЕ відображені в багатьох монографіях [1, 126, 176]. Ми застосували в своїй роботі один з видів МПЕ, а саме схему повного факторного експерименту (ПФЕ). Завдання МПЕ полягає в отриманні статистичної форми зв'язку виходів системи (значень відгуку) з входами, тобто з діючими чинниками.
Чинником може бути будь-яка дія, але для МПЕ важливо, щоб кожен чинник був незалежний від інших, тобто щоб була можливість встановлювати рівень кожного з них незалежно від рівнів інших чинників. Рівнем чинника називатимемо одне з значень, що приймаються ним, з діапазону доз, який становить для нас інтерес в конкретному експерименті. Інакше кажучи, рівень чинника - це доза його дії на всю систему в цілому або її окремі частини (підсистеми).
Певний набір рівнів застосованих чинників (факторів) задає один з можливих станів досліджуваного об'єкта. Кожному поєднанню рівнів чинників відповідає один з можливих дослідів. Всі можливі набори значень рівнів чинників задають безліч станів досліджуваної системи. Щоб отримати опис всіх можливих станів об'єкта (в межах вживаного діапазону значень чинників) необхідно поставити серію дослідів, число яких дорівнює числу станів об'єкта, і яке визначається за формулою N = nk, де N - число станів об'єкта, n - число рівнів (значень) кожного чинника, k - число чинників. Наприклад, у разі випробування трьох чинників, кожний з яких приймає по два значення (рівня) задаються 8 (23) станів об'єкта і, відповідно, стільки ж необхідно провести незалежних дослідів, щоб отримати інформацію про ці стани. Зрозуміло, кожний з дослідів проводиться в певній повторності, що задається варіабельністю об'єкта дослідження, яка приймається апріорною або береться з даних попередніх експериментів (апостеріорна інформація).
Реалізація процедури МПЕ зводиться до знаходження чисельних значень параметрів математичної моделі об'єкта, у якості якої виступає регресійне рівняння, що описує зв'язок виходу системи ("чорного ящика") з діючими чинниками. У загальному вигляді це рівняння можна записати так:
Y = f(X1,X2,...,Xn) .
Така функція називається "функцією відгуку". Оскільки дійсний вид функції відгуку заздалегідь невідомий, використовують регресійну модель цієї функції - розкладання її в ступеневий ряд:
n n
Y = B0 +?BiXi, + ?BijXij +
i=1 i,j=1
де Xi,Xj, - змінні (чинники), Bi,Bj - коефіцієнти регресії при відповідних змінних. Приведене рівняння називають рівнянням регресії. Коефіцієнти регресії дозволя