РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали [?-32Р]АТР (удельная активность >1000 Ки/ммоль), натрий уксуснокислый - 114С (10-50 мКи/ммоль) (ВПО "Изотоп"), тритон Х-100, сахарозу, EGTA ("Serva", Германия); EDTA, фенилметилсульфонилфторид (PMSF), 8-(диэтиламино)октил 3,4,5-триметоксибензоат (ТМВ-8) ("Fluka", Швейцария), Hepes, трипановый синий ("Serva", Германия), неомицин, пропранолол, 1-(5-изокуинолинсульфонил)-2-метилпиперазин (Н7) ("Sigma", США), АТР (динатриевая соль), L-тироксин ("Reanal", Венгрия), фосфоцеллюлозную бумагу Р-81, DEAE-целлюлозу DF-52 ("Whatman", Англия), силикагель ("Woelm", Германия); [14С]олеиновую кислоту (58 мКи/ммоль), [3Н]пальмитиновую кислоту (54 Ки/ммоль), [14С]пальмитиновую кислоту (60 мКи/ммоль), [14С]линолевую кислоту (59 мКи/ммоль), глицеролтри(9, 10(n) -[3Н]олеат) (1 Ки/ммоль) ("Amersham", Англия); [U-14C]глюкозу (0,1-1 мКи/ммоль) ("Hemapol", Чехия).
2.1. Постановка эксперимента
При выполнении настоящей работы использовали белых крыс линии Вистар, самцов 3-х и 24-месячного возраста, содержащихся в стандартных условиях вивария Харьковского национального университета. Объектом исследования служили: суспензия ткани печени, изолированные гепатоциты крыс, печень, перфузируемая in situ. Животные были разделены на группы в зависимости от задачи эксперимента:
1. Интактные животные, из печени которых получали суспензию ткани или выделяли гепатоциты.
2. Животные, которым вводили одноразово (внутрибрюшинно) L-тироксин в дозе 200 мкг/100 г массы тела за 15, 30, 60, 120 мин. до забоя. Контрольные животные, которым вводили (внутрибрюшинно физиологический раствор (0,9% NaCl) в объеме, соответствующем объему вводимого гормона.
3. Животные, которым внутрибрюшинно вводили 1-метил-2-меркаптоимидазол (мерказолил) (1 мг на 100 г массы животного) в течение 16 дней. Печень перфузировали in situ Кребс-Хенселейт буфером рН 7,5 с добавлением L-тироксина (10 нМ) или растворителя гормона NaOH (100 нМ) в течение 2, 5, 10 мин (за основу взята модель, описанная ранее [123]).
2.2. Получение гепатоцитов
Гепатоциты из печени крыс выделяли коллагеназным методом [201], а также согласно методу Канаевой и соавт. [202] с некоторыми модификациями. Для этой цели вскрывали брюшную полость наркотизированного животного (эфирный наркоз) и проводили перфузию печени 100 мл 0,9% NaCl и 100 мл инкубационной среды, содержащей 250 мМ сахарозы, 5 мМ КCl, 0,4 мМ КН2РО4, 2 мМ дитиотрейтола, 1 мМ ЭДТА, 0,8 MgCl2, 1% альбумина сыворотки крови быка, рН 7,4. Печень извлекали, помещали в стакан, содержащий 40 мл (из расчета на 7 г печени) среды инкубации и подвергали вибрации с помощью прибора АВ-10П в течение 15 мин. Печень продавливали через пластину с диаметром пор 0,3 мм и фильтровали через 4 слоя марли, добавляли 40 мл (из расчета на 7 г печени) среды инкубации и центрифуговали 2 мин. при 500 об/мин. К осадку добавляли 50 мл среды инкубации. Операцию центрифугирования повторяли дважды. Все растворы для получения гепатоцитов предварительно в течение 1 часа аэрировали смесью 95% О2 - 5% СО2. Гепатоциты ресуспендировали в среде инкубации. Нативность клеток тестировали с помощью красителя трипанового синего. Выход нативных клеток - 90-95%.
2.3. Приготовление суспензии ткани печени
Печень промывали 0,9% раствором NaCl, затем буфером Кребс-Хенселейта рН 7,4, содержащим 2 мМ CaCl2, 0,2% БСА. Печень извлекали и продавливали через перфорированную пластину с диаметром пор 0,3 мм. Суспензию ткани преинкубировали в буфере Кребс-Хенселейта в течение 5 мин при 37? С перед добавлением гормона.
2.4. Включение изотопной метки в состав эндогенных липидов
печени крыс
Крысам (голодавшим в течение 20 часов и накормленным за 3 часа до инъекции) вводили внутрибрюшинно 0,5 мл раствора ацетата-1-14С натрия (активностью 0,5 или 1,0 мКи) четырьмя порциями с интервалом в 30 мин. согласно схеме, предложенной Кейтсом [203]. Через 2 часа животное забивали, печень извлекали и использовали для получения суспензии ткани.
2.5. Эксперименты с суспензией ткани печени
Суспензию ткани печени инкубировали в буфере Кребс-Хенселейта
рН 7,4, содержащем 0,1% БСА в присутствии L-T4 (10 нМ) или растворителя гормона - NaOH (100 нМ) в течение определенных интервалов времени (0,25-15 мин).
В отдельных экспериментах [14С]глюкозу, [14С]олеиновую кислоту или глицеролтри-(9,10 (n)- [3Н]олеат) добавляли в среду инкубации суспензии ткани печени в количестве 2 мкКи/мл, 0,2 мкКи/мл, 0,1 мкКи/мл, соответственно, одновременно с внесением гормона или его растворителя. В экспериментах с использованием [14С]олеата или [14Н]триолеата инкубацию проб проводили в присутствии 0,01% тритона Х-100. Время инкубации суспензии ткани печени 15 мин. Реакцию останавливали смесью хлороформ:метанол (1:2). Липиды эстрагировали и анализировали, как описано ниже.
2.6. Эксперименты со свежевыделенными гепатоцитами
Свежевыделенные гепатоциты (107 кл/мл) метили путем инкубации клеток в течение 90 мин или 3 ч в среде Игла рН 7,5, содержащей [14С]олеиновую кислоту (1 мкКи/мл), 25 мМ Hepes, 200 мМ глутамин, пенициллин (61 мг/л), стрептомицин (100 мг/л), 10%-ную эмбриональную бычью сыворотку, при 37?С в атмосфере О2 (95%) - СО2 (5%). В отдельных случаях использовали [14С]линолевую кислоту или [3Н]пальмитиновую кислоту (5 мкКи/мл).
2.7. Эксперименты с культурой гепатоцитов
При введении метки в состав гепатоцитов в условиях длительной инкубации (24 ч) в инкубационную среду, содержавшую [14С]олеиновую кислоту (2,5 мкКи/мл), [14С]пальмитиновую кислоту (6,0 мкКи/мл) дополнительно вносили дексаметазон (4 мг/мл), инсулин (20 ед/л), гентамицин (13 мг/мл). Концентрация клеток в данном случае составляла 3?106 клеток на 1 мл. Инкубацию проводили при 37? С, в атмосфере воздух (95%) - СО2 (5%).
2.8. Эксперименты с мечеными гепатоцитами