РОЗДІЛ 2
ОБ’ЄКТ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Рослинний матеріал
У роботі використовували цибулю сорту Сквирський. Експерименти проводили із
суспензійною культурою клітин A. cepa.
Отримання калюсної тканини. У якості експлантів використовували денця цибулин
і сегменти асептично вирощених 7-денних проростків. Вихідний матеріал (цибулини
і насіння) стерилізували в 70%-ному етанолі (1-1,5 хв), а потім у 30%-ному
водному розчині комерційного відбілювача “Белизна”(40 хв), після чого відмивали
кілька разів стерильною дистильованою водою. Насіння пророщували на 1/10
агаризованого середовища Гамборга (В5) [227] у темряві при 24°С.
Калюс ініціювали поміщенням експланту на агаризоване поживне середовище. Для
пересадки використовували калюс після 4-тижневого періоду культивування у
темряві при 25°С.
Отримання суспензійної культури. Суспензійну культуру отримували, поміщуючи
шматочки калюса в колби Ерлейнмеєра з рідким поживним середовищем (приблизно 1
г тканини на 20 мл середовища). Суспензійну культуру культивували протягом 4
тижнів на реципрокному шейкері (120 коливань/хв) у темряві при 25°С. Для
експериментів використовували суспензію клітин після 3 пасажів.
2.2.Еліситори
У роботі використовували біогенні еліситори, виділені з фітопатогенного гриба
B. cinerea (неспецифічного патогену цибулі) (штам №2307), отриманого з колекції
Інституту мікробіології та вірусології НАН України.
Для отримання еліситорів міцелій B. сinerea вирощували протягом 14 діб на
рідкому поживному середовищі Чапека [228]. Культуральне середовище
відфільтровували від міцелію гриба.
З культурального фільтрату отримували білкову фракцію шляхом осадження білків
сульфатом амонію (10 – 80%) [229].
Цитоплазматичний вміст міцелію гриба виділяли за методом Чалової у модифікації
Перковської [230]. Для цього міцелій гриба промивали дистильованою водою,
підсушували і екстрагували 70 %-ним етиловим спиртом на кип’ячій водяній бані
зі зворотним холодильником протягом 20 хв. Концентрацію екстрактів
розраховували за масою сухого міцелію на об’єм екстрагенту (1 г : 10 мл).
Спиртовий екстракт внутрішньоклітинного вмісту міцелію відфільтровували, спирт
видаляли із супернатанту в ротаційному випаровувачі. Водний залишок
використовували для гель-хроматографії на сефадексі G-75. Відбирали окремо
фракції при елюції дистильованою водою. В одержаних фракціях визначали вміст
білка за методом Лоурі [229] і вуглеводів – за реакцією з фенол-сірчаною
кислотою [231]. Об’єднували фракції, які містили вуглеводи.
Препарат клітинних стінок гриба одержували за допомогою методу Чалової та ін.
[232]. Для цього екстрагований міцелій руйнували ультразвуком, ретельно
промивали, підсушували, видаляли ліпіди шляхом поетапного промивання сумішшю
органічних розчинників і гідролізували у 1М NaOH при кімнатній температурі
протягом 24 год. У одержаній фракції визначали вміст вуглеводів.
Хітозан готували за методикою Каусса та ін. [34].
2.3.Кількісне визначення О2-. у клітинах A. cepa
Визначення О2-. проводили хемілюмінесцентним методом.
Ми модифікували метод високочутливого визначення О2-. за допомогою
хемілюменометра ХЛМ1Ц – 01 (Україна), запропонований Корбісієром та ін. [233]
для тваринних клітин.
У експериментах використовували суспензійну культуру цибулі через 5 днів після
субкультивування. Клітини осаджували центрифугуванням при 100 g 5 хвилин, після
чого їх тричі відмивали від поживного середовища з інтервалом 30 – 40 хвилин.
Для цього використовували розчин наступного складу: 1 мМ СaCl2, 0,1 мМ KCl, 0,1
мМ MgCl2, 0,088 М сахарози, 1 мМ МЕS, рН 5,6. Протягом процедури відмивання
клітини інкубували на шейкері (110 коливань/хв) при 25 °С і використовували для
експериментів через 2 години після останнього відмивання (густина клітин
становила 1 мл осаджених клітин/10 мл середовища).
Активність СОД інгібували ДДК (1мМ). З ДДК клітини інкубували протягом 5
хвилин.
Експеримент проводили за двома напрямками: 1) клітини обробляли еліситором, в
певний час відбирали аліквоти і поміщали у кювету; 2) аліквоту клітин
переносили у кювету і обробляли еліситором.
Для визначення О2-. як люмінесцентний барвник використовували люцигенін, який
є специфічним до О2-..
Загальний об’єм зразку у кюветі становив 2 мл. 0,2 мл суспензії клітин
поміщали у кювету з 1,6 мл гліцин-NaOH буферу (рН 9.0), який містив 1мМ ЕДТА,
та 0,2 мл 1мМ люцигеніна (розведеного у цьому ж буфері).
2.4. Кількісне визначення Н2О2
Виділення Н2О2 клітинами суспензійної культури A. cepa аналізували двома
методами: 1) спектрофлуориметричним методом з використанням флуорофора піраніна
за методом Апостола та ін. [184] та 2) спектрофотометричним методом за Ван
Гестелен та ін. [234].
1) Клітини суспензійної культури відмивали і ресуспендували як зазначено вище.
Після цього обробляли еліситором і в певний час відбирали аліквоти. 2 мл
аліквоти суспензії клітин поміщали у кювету і додавали 4 мкл водного розчину
піраніна (у концентрації 1 мг/мл). Зміни інтенсивності флуоресценції протягом
години після обробки еліситором реєстрували на спектрофлуориметрі СДЛ-2
("ЛОМО", Росія). Довжина хвилі вимірів складала 512 нм, довжина хвилі збудження
- 405 нм.
2) Клітини суспензійної культури відмивали і ресуспендували як зазначено вище.
Після цього обробляли еліситором і/або різними речовинами і в певний час
відбирали аліквоти. До 0,98 мл суспензії клітин додавали 10 мкл 1 мкМ водного
розчину 4-аміноантипірину, 10 мкл 10 мкМ водного розчину
3,5-дихлоро-2-гідроксибензенсульфонової кислоти та 1 од./мл пероксидази. Через
5 хв суспензію центрифугували (5 хв, 100 g). Оптичну густину супернатанту
вимірювали на спектрофот
- Киев+380960830922