РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкти та умови досліджень
Об'єктами досліджень були кукурудза (Zea mays L.) сорту Закарпатська жовта зубоподібна та соя (Glycine max. (L.) Merr.) сорту Київська 27. Насіння пророщували на фільтрувальному папері, змоченому дистильованою водою протягом двох діб у темноті в термостаті при температурі 240 С. На третю добу росту проростки переносили на розчин Кнопа. Після 3 діб росту проростків поживний розчин замінювали на розчини хлориду кадмію у концентраціях 10-8, 10-7, 10-6 М. Для забезпечення сталого іонного складу розчини замінювали кожні 2 доби. Контрольні рослини вирощували на дистильованій воді.
З метою дослідження протекторної ролі заліза проростки переносили на розчини, що містили залізо у формі хлориду (FeCl3 · 6H2O) у наступних концентраціях (мг/л): 0,5 (дефіцит), 1 (норма), 2 та 4 (надлишок). Кадмій (у формі CdCl2) додавали у поживний розчин у концентраціях 10-8 та 10-6 М. Рослини вирощували у контрольованих умовах освітлення (2,0 - 2,2 тис.лк), температури (20 - 250С) і 14-годинній тривалості дня. Для досліджень використовували 12-добові рослини.
2.2. Кількісне визначення вмісту вільних амінокислот у рослинному матеріалі
Наважки коренів та пагонів (1 г) досліджуваних рослин сої та кукурудзи розтирали у 5 мл 3% водного розчину сульфосаліцилової кислоти. Гомогенат центрифугували 20 хв при 10 000 об/хв і температурі 40С. Після центрифугування супернатант використовували для досліджень.
Якісне і кількісне визначення вільних амінокислот проводили на автоматичному амінокислотному аналізаторі типу Т-339 ("Microtechna", Чехословаччина) на сульфополістирольних іонообмінних смолах у Li-цитратному буферному одноколонковому режимі. Амінокислоти детектували за допомогою розчину нінгідрину на проточному фотометрі при довжині хвилі 560 нм. Результати детекцій реєстрували самописцем на папері у формі піків адсорбцій світла нінгідринпозитивними речовинами, адсорбція прямо пропорційна концентрації даної речовини у розчині [91].
Кількісну оцінку хроматограм досліджуваного зразка проводили відносно стандартної суміші амінокислот фірми PIERCE (США).
Кількість мікромолей кожної амінокислоти (Xi) в досліджуваному зразку розраховували за формулою: Xi = S1/S0, де S1 - площа піку амінокислоти в досліджуваному розчині; S0 - площа піку цієї ж амінокислоти в розчині стандартної суміші амінокислот, яка відповідає одному мікромолю. Кількість кожної амінокислоти в міліграмах отримують при множенні кількості мікромолей амінокислоти на відповідну їй молекулярну масу.
Розрахунки кількісного і якісного складу амінокислот здійснювали із застосуванням комп'ютерних програм. Середні значення вмісту амінокислот визначали із чотирьох повторних аналізів.
2.3. Визначення вмісту білка у рослинному матеріалі
Загальний білок визначали за методом М. Бредфорда [164]. Метод ґрунтується на кольоровій реакції білків та барвника Кумасі блакитний, внаслідок чого утворюється забарвлений комплекс із максимумом поглинання 595 нм.
Для проведення аналізу свіжий матеріал подрібнювали і розтирали в охолодженому до 40С трис- гліциновому буфері (рН=8,3). Співвідношення рослинного матеріалу до буфера 1 : 1. Одержану суміш центрифугували при 3 000 об/хв. Відбирали 0,1 мл супернатанту, додавали 8 мл Н2О і 2 мл розчину Кумасі блакитний та фотометрували за ?=595 нм. За калібрувальним графіком визначали концентрацію білка у зразку. Калібрувальний графік будували за результатами, отриманими при вимірюванні оптичної густини продукту реакції барвника із розчином альбуміну ("Sigma", США) у концентраціях 1 - 10 мкг/мл. Вміст білка перераховували на 1 г маси сухої речовини.
2.4. Визначення біологічної активності ІОК, зеатину, зеатинрибозиду та АБК
Екстрагування фітогормонів з органів рослин кукурудзи проводили за методом В. Кефелі та ін. [53] - для АБК та ІОК і В.Негрецького та ін. [95] - для цитокінінів. Наважку рослинного матеріалу 3 г фіксували у рідкому азоті, гомогенізували та екстрагували фітогормони 80 % етанолом (із розрахунку 10 мл на 1 г маси сирої речовини) двічі по одній годині та один раз протягом 20 хвилин при температурі +40С. Відцентрифуговані етанолові екстракти об'єднували та концентрували до водного залишку і центрифугували при 6 тис.об./хв протягом 20 хвилин.
Для екстрагування АБК та ІОК супернатант доводили до рН 2,7 - 3,0 10% сірчаною кислотою і переводили гормони в очищений від пероксидів діетиловий ефір. Операцію проводили тричі. Ефірну фракцію відокремлювали і концентрували до сухого залишку.
Для екстрагування цитокінінів використовували водний залишок, що залишився. Екстракцію повторювали тричі водонасиченим н-бутанолом при рН 8,0. Об'єднані бутанольні фракції випаровували до сухого залишку. Сухі залишки розчиняли в 1 мл 96 % етанолу.
Подальше очищення та концентрування екстрагованих фітогормонів проводили за методикою С. Савінського та ін. [113]. Для цього проводили трикратну тонкошарову хроматографію на пластинках "Silufol" UV 250 (Чехія) у наступних системах розчинників: 1) хлороформ; 2) 12,5 % аміак; 3) хлороформ : етилацетат : льодяна оцтова кислота (100 : 100 : 1) - для АБК та н-бутанол : аміак : вода (86 : 5 : 9) - для цитокінінів. Для ідентифікації гормонів використовували свідків: цис-транс АБК фірми "Sigma" (США) і зеатин та індоліл-3-оцтова кислота фірми "Serva" (США).
Біологічну активність екстрагованих фітогормонів аналізували методом біотестування. Для цього відстань від старту до фронту розчинника на пластинці ділили на 10 поперечних рівних зон, які вирізали і проводили елюювання 96 % етанолом протягом ночі у темряві при температурі +300С. Елюати випаровували, а сухі залишки використовували для аналізу біологічної активності. Для АБК та ІОК біотестом слугували колеоптилі пшениці сорту Миронівська 808 [13], для цитокінінів - сім'ядолі огірка сорту Далекосхідний [109]. Насіння, що використовувалось для біотестування, було пер