РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали і методи експериментальних досліджень
2.1.1. Експериментальні тварини.
Об'єктом досліджень були експериментальні тварини (40 щурів-самців лінії Вістар вагою 180-250 г), утримання і догляд за якими відповідали загальноприйнятим нормам [28].
2.1.2. Індукція гострого панкреатиту.
Індукцію ЕГП проводили згідно з моделлю Aho Н. і співавт., 1980, з деякими модифікаціями [112]. В асептичних умовах під загальною анестезією (кетамін 100 мг/кг ваги внутрішньом'язево [206]) виконували серединну лапаротомію. Тимчасово кліпували жовчну протоку у воротах печінки для попередження ретроградного попадання рідини, що використовувалась для індукції ГП. Протокову гіпертензію створювали шляхом введення жовчі (2 мл/кг ваги) у біліопанкреатичну протоку після трансдуоденальної пункції останньої за допомогою інсулінової голки, після чого протоку перев'язували у місці впадіння у дванадцятипалу кишку. Перед зашиванням черевної порожини брали бактеріологічний посів для виключення непередбаченого її інфікування.
2.1.3. Визначення бактеріальної транслокації та порушень екосистеми кишечнику.
Для вивчення транслокації мікроорганізмів в стерильних умовах набирали по 0,2 мл крові з нижньої порожнистої вени, ворітної вени, асцитичної рідини, досліджували не менше 3-х брижових лімфатичних вузлів (визначали якісний склад флори), а також вміст дистальної частини тонкої кишки і поперечно-ободової кишки - визначали вид і кількість мікроорганізмів (колонії-формуючі одиниці (КФО) в 1 мл кишкового вмісту).
Бактеріологічне дослідження кишкового вмісту, крові, мезентеріальних лімфатичних вузлів (позитивним результатом дослідження вважали наявність мікроорганізмів не менш, ніж у двох лімфатичних вузлах) проводили відповідно до рекомендацій, що описані в керівництві з мікробіологічної діагностики інфекційних хвороб під редакцією К.І.Матвєєва [77]. Посіви матеріалу проводилися на тіогліколеве середовище (загальні анаероби, біфідо- і лактобактерії), на середовище Ендо (E.coli, Enterobacter spp. та ін.), кров'яний агар. Забарвлення препаратів проводилося за Грамом (методика стандартна).
2.1.4. Патоморфологічне дослідження.
Для виявлення характерних особливостей розвитку захворювання і його ускладнень проведені гістологічні, гістохімічні і електронно-мікроскопічні дослідження ПЗ і кишечнику в усіх експериментальних спостереженнях.
Для світлооптичного дослідження матеріал фіксували у 10% розчині нейтрального формаліну забуференому за Лілі. Парафінові зрізи забарвлювали гематоксилином-еозином, пікрофуксином у поєднанні з резорцинфуксином за Ван Гізоном. Нейтральні глікозаміноглікани визначали за допомогою ШИК-реакції, кислі - забарвленням альциановим синім при різних значеннях рН розчину барвника (1,0 - 2,5). Для виявлення в одному і тому ж субстраті кислих і нейтральних глікозаміногліканів використовувалась комбінована реакція за Моурі. Результати гістохімічних реакцій оцінювали за локалізацією й інтенсивністю забарвлення.
З метою проведення електронно-мікроскопічного дослідження, для попередньої фіксації фрагменти тканини тонкої кишки занурювали у 2,5% розчин глютарового альдегіду на 2-4 години при температурі 4°С. Після завершення попередньої фіксації тканину промивали у буферному розчині і клали для кінцевої фіксації в 1% забуферений розчин чотирьохокису осмію на 2-3 години при температурі 4°С. Потім тканину дегідратували у спиртах зростаючої концентрації та ацетоні, занурювали у суміш епоксидних смол (епол-аралдіт) і ставили у блоки. Полімеризацію блоків проводили у термостаті при температурі 60°С впродовж двох діб.
Ультратонкі зрізи виготовляли на ультрамікротомі УМТП-6, монтували їх на електролітичні сіточки і, після контрастування цитратом свинцю, вивчали під електронним мікроскопом ЕМВ-100 БР при прискорюючій напрузі 75 кВ.
Збільшення підбиралось адекватне меті дослідження і коливалось у межах 20000 - 50000 раз.
Контролем якості гістологічної обробки служили фрагменти тканини тонкої кишки інтактних тварин.
2.1.5. Визначення загальної та кишкової екстракції кисню.
Екстракція кисню визначалася за його складом в аорті, нижній порожнистій вені і ворітній вені з використанням загальноприйнятих формул (Рябов Г.А., 1988), для чого набирали по 0,4 мл крові з названих судин, визначали рівень гемоглобіну за уніфікованою методикою, напруження кисню і насичення гемоглобіну киснем за допомогою кислотно-основного аналізатора АВС 1 Radiometer (Данія).
Вміст кисню, що переноситься кров'ю, визначався за формулою [79]:
SО2 = (Hb?1,39?SaО2)?(PO2 ? 0,0031),
де
SО2 - вміст кисню;
Hb - концентрація гемоглобіну, г/дл;
1,39 - константа Хюфнера (кількість кисню в мл, який максимально може приєднати один грам гемоглобіну);
SaО2 - насичення гемоглобіну киснем;
PO2 - напруження кисню у крові, мм рт. ст.;
0,0031 - коефіцієнт Бунзена (відображає розчинність кисню у плазмі за стандартних умов).
Загальна екстракція кисню визначалася за різницею вмісту кисню в аорті і нижній порожнистій вені:
ERO2 заг = SO2 (A) - SO2 (НПВ) / SO2 (A),
де
ERO2 заг - загальна екстракція кисню;
SO2 (A) - вміст кисню в аорті;
SO2 (НПВ) - вміст кисню в нижній порожнистій вені.
Кишкова екстракція кисню визначалася за різницею вмісту кисню в аорті і ворітній вені:
ERO2 шкт = SО2 (А) - SО2 (ВВ) / SО2 (А),
де
ERO2 шкт - кишкова екстракція кисню;
SO2 (A) - вміст кисню в аорті;
SO2 (НПВ) - вміст кисню в ворітній вені.
2.1.6. Схема експерименту.
Всі тварини були розподілені на дві групи. У І групу (контрольну) увійшло 20 щурів, яким виконували тільки лапаротомію, у ІІ групу
(основну) - 20 щурів, у яких викликали ЕГП. Для проведення вказаних вище досліджень тварин повторно оперували в наступні терміни: 30 хвилин, 2, 6, 12 і 24 години після первинного втручання (по 4 щури в кожній серії). Наприкінці повторних операцій щурі виводились з експ