РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ, МЕТОДЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объекты исследования и приготовление образцов
В работе использовали яичный фосфатидилхолин, кардиолипин из сердца быка ("Биолек", Харьков), гель Sefadex G-75 ("Pharmacia", Швеция), полиэтиленгликоль-1500 ("Loba-Chemie", Швеция), другие реактивы отечественного производства квалификации "ч. д. а." и "х. ч.".
Оксигемоглобин А (HbA) человека выделяли из свежей крови осмотическим лизисом эритроцитов, предварительно трижды отмытых изотоническим раствором NaCl (150 мм). Гемолизат готовили путем добавления одного объема дистиллированной воды и хранения 24 часа при +4оС , далее осаждали разрушенные клеточные мембраны при помощи ультрацентрифугирования при 15000 g в течение 15 мин. Гемоглобин А очищали методом гель-проникающей хроматографии на колонке диаметром 25 мм и длиной 40 с сефадексом G-100 (Fine) фирмы Pharmacia (Швеция). Отцентрифугированный раствор гемоглобина (надосадок) наносили на колонку и проводили элюцию при +4оС. Концентрация гемоглобина в растворе контролировалась на спектрофотометре PYE UNICAM 8000 (Великобритания) на длине волны 577 нм.
Оксигемоглобин F (HbF) человека выделяли из свежей кордовой крови. Гемолизат готовили, как описано выше. Фетальный гемоглобин выделяли из гемоглобина кордовой крови путем денатурирования гемоглобина А раствором NaOH и последующего осаждения денатурированного гемоглобина А насыщенным раствором сульфата аммония. Гемоглобин F очищали на хроматографической колонке так же, как это описано для гемоглобина А. Выход белка контролировали спектрофотометрически по поглощению раствора при 560 и 577 нм [ 111 ].
Растворы криопротекторов (содержащие 0,15М NaCl) готовили концентрациями 10-40%, выдерживали 20 мин после перемешивания.
В эксперименте по связыванию фетальным гемоглобином органического красителя бромтимолового синего использовали растворы HbА и HbF в 0,05М Na-фосфатном буфере, рН 7,2. Содержание оксиформ HbА и HbF в гемолизатах перед выделением гемоглобинов составляло 90± 2%). Растворы БТС готовили на 0,05М Na-фосфатном буфере, рН 7,2. Время контакта HbА и HbF с БТС составило 20 мин. Концентрации HbА и HbF в образцах, определенные спектрофотометрически, составили 0,81,4?10-5М и 1,21,5?10-5М, соответственно; концентрации БТС - 530?10-6М.
Метгемоглобины А и F (метHbA и метHbF) получали путем окисления оксигемоглобинов А и F избытком 1М феррицианида калия и очищения полученных растворов на хроматографической колонке.
Для приготовления липосом из фосфатидилхолина (ФХ) и кардиолипина (КЛ) этанольный раствор липидов выпаривали на воздухе досуха, к липидной пленке добавляли 5мМ трис-HCl-буфер, рН 7,4, содержащий 0,15М NaCl. Конечная концентрация липидов составляла 20 мг/мл. Суспензию механически встряхивали 10 мин и полученную грубую дисперсию обрабатывали 10 мин ультразвуком с помощью диспергатора УЗДН на частоте 22 кГц [ 96 ]. Липосомы сформированы в весовом соотношении ФХ:КЛ = 4:1.
Для экспериментов по взаимодействию HbA и HbF с липосомами использовали растворы HbA и HbF на трис-HCl-буфере, рН 7,4, содержащем 0,15М NaCl.
Реакцию комплексообразования метгемоглобинов и оксигемоглобинов A и F с липосомами проводили при +20оС. Весовое соотношение липид:белок составляло 1:3, либо молярное соотношение липид:белок было в пределах 1?10-2 : 1?10-4.
2.2. Методы и методика исследования
Ультрафиолетовая спектрофотометрия белков.
Спектры поглощения (СП) в ультрафиолетовой и видимой областях обусловлены электронными переходами молекул из основного в возбужденное состояние при поглощении квантов света. Энергия поглощаемого кванта зависит от электронной структуры хромофора - молекулы или группы, ответственной за поглощение света. СП собственных хромофорных групп белка (пептидной группы и боковых аминокислотных радикалов) лежат в ультрафиолетовой области. В видимой области спектра свет поглощают белки, содержащие геминовую группу (гемоглобин, каталаза, цитохромы), флавопротеиды, пиридоксальфосфат - содержащие ферменты, а также ряд других белков, содержащих ионы железа и меди. Белковую молекулу в спектральном отношении можно рассматривать как сложную систему хромофоров, различных по структуре и свойствам. Специфические полосы поглощения, по которым можно было бы производить отличие спектров белка от спектров веществ небелковой природы, в белке отсутствуют. В первом приближении СП белка - сумма спектров составляющих белок хромофорных групп. Наиболее изученные области СП белков - 190-200 нм - область поглощения пептидной связи (однако в большинстве белков значительный вклад в поглощение белка при этих длинах волн вносят боковые аминокислотные остатки) и область 280 нм, в которой спектр белка определяется поглощением света тирозином и триптофаном. Кроме того, в этой области спектра вклад в поглощение дают остатки фенилаланина, цистеина, цистина и метионина, но их поглощение очень слабое и на фоне тирозина и триптофана оно не заметно. СП триптофана обусловлен электронными переходами в системе делокализованных ? электронов. Наиболее значительные изменения в СП тирозина имеют место при депротонизации ОН-группы (образовании фенолятной формы). В гемоглобине СП обусловлен переходами электронов кольца двойных связей вокруг атома железа в геме [ 111 ].
СП растворов гемоглобина записывали на двухлучевом спектрофотометре PYE UNICAM 8000 (Великобритания). Ошибка в измерении спектрофотометром оптической плотности составляет ?0,002 о.е., в определении длины волны ?1 нм.
Сольвентно-пертурбационные дифференциальные спектры.
Поверхностные хромофорные группы белка, как и свободные аминокислоты в растворе, реагируют на изменения полярных свойств растворителя, что ведет к пертурбации их СП. Таким образом, можно использовать контролируемые воздействия пертурбантов (компонентов растворителя, вызывающих пертурбацию спектров хромофорных групп) для определения количества поверхностных, доступных растворителю, хромофо