РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Для вирішення поставлених завдань проводили експериментальні дослідження. Об'єктом дослідження служили дволітки коропа (Cyprinus carpio L.), які були вирощені на Білоцерківській експериментальній гідробіологічній станції Інституту гідробіології НАН України. До початку дослідів риб витримували протягом двох місяців у басейнах місткістю 1м3 при температурі води 18-200С. В цей період її годували гранульованим рибним комбікормом К-ІІІ-10.
По 6 штук риб масою 200-220 г. поміщали у 100-літрові акваріуми, які були заповнені відстояною водопровідною водою та обладнані термо- та газорегуляторами для підтримання стандартних рівнів гідрохімічних показників. Вміст О2 у воді акваріумів становив 7,52+0,19 мг/дм3, СО2 - 2,34+0,13 мг/дм3, а величина рН - 7,64+0,13.
Концентрації іонів міді 0,5; 2; 5 і 10 мкг/дм3 і марганцю 5; 20; 50 і 100 мкг/дм3, які відповідали 0,5; 2; 5 і 10 рибогосподарським ГДК [86, 97] створювались додаванням у воду акваріумів відповідних кількостей CuSO4?5H2O і MnSO4?5H2O у розрахунку на катіон. Фоновий вміст міді і марганцю у воді контрольних акваріумів дорівнював відповідно 0,14+0,05 і 0,24+0,02 мкг/дм3. З метою запобігання впливу екзометаболітів на риб та підтримання на постійному рівні певних концентрацій іонів міді і марганцю у воді акваріумів раз у два дні проводили її заміну з додаванням відповідних кількостей іонів міді та марганцю. Період аклімації риб до таких умов водного середовища складав 14 діб. Такий час на думку деяких вчених [115], є необхідним для формування адаптивних механізмів до дії абіотичних чинників водного середовища, в тому числі і важких металів. Контролем служили величини досліджуваних показників в тканинах риб, що знаходились у воді акваріумів без додаткового введення іонів міді та марганцю. Температура води в акваріумах під час проведення дослідів підтримувалась на рівні 200С автоматично.
Для оцінки стану енергозабезпечення процесів адаптації риб до дії іонів міді та марганцю водного середовища були використані сучасні методи досліджень.
Величини біохімічних показників, які характеризують окисно-відновні реакції, визначали в тканинах печінки, зябер та білих м'язів риб. Останніх вбивали, перерізуючи скальпелем хребет нижче голови, швидко відбирали тканини, заморожували їх в рідкому азоті, розтирали в порошок та використовували для визначення величин досліджуваних показників.
Активність цитохромоксидази (ЦО) (цитохром С: О2-оксидоредуктаза; МКФ 1.3.99.1) в 10% тканинних гомогенатах, приготовлених на фосфатному буфері (0,025 М, рН 7,4) визначали за методом Штрауса [195]. При цьому використовували інкубаційне середовище, яке складалось із: 0,025 М фосфатного буферу (рН 7,4), 0,1% ?-нафтолу, виготовленому на 22% спирті, 0,1% розчину хлориду диметилпарафенілендиаміну, 0,02% розчину цитохрому С. Інкубацію проводили в термостаті при температурі 250С протягом 20 хв. Реакцію зупиняли ефірно-спиртовою сумішшю (9:1), яка і сприяла екстракції індо-фенолового забарвлення, що при цьому утворювалось. Екстинцію заміряли на фотоелектроколориметрі ФЕК-56М при 540 нм. Розчином порівняння при фотоколориметруванні слугувала ефірно-спиртова суміш (9:1). Активність цитохромоксидази виражали в нмоль індофенолу синього на мг білка за час інкубації (20 хв).
Вміст метаболітів гліколізу та трикарбонового циклу в тканинах риб визначали загальноприйнятими ферментними методами. Тканинні екстракти приготовляли на охолодженій 6% хлорній кислоті (у співвідношенні 1г розтертого порошку тканини на 7 мл кислоти). Після нейтралізації гомогенату до рН 7,0 КОН та видалення хлоратів центрифугуванням 10 хв. при температурі 2-30С екстракт використовували для визначення рівня метаболітів гліколізу і трикарбонових кислот.
Для визначення вмісту пірувату [154] в тканинах риб готували інкубаційну суміш із трис НСl (рН 7,66), НАДH (7 мг на 1 мл бідистильованої води) та ЛДГ ("Реанал", Угорщина), яку розводили водою у співвідношенні 1: 25.
Вимірювання проводили на спектрофотометрі при довжині хвилі 340 нм. Вміст пірувату виражали в мкмолях на 100 г сирої тканини.
Визначення лактату в тканинах риб проводили згідно методу [155]. Для цього готували інкубаційну суміш із гліцин-гідразинового буферу (рН 9,5), НАД+ (33 мг на 1 см3 бідистильованої води) та ЛДГ, розведеної у воді (1:1). Вимірювання проводили на спектрофотометрі при довжині хвилі 340 нм. Вміст лактату виражали в мкмоль на 1 г сирої тканини.
Для визначення вмісту щавлево-оцтової кислоти (ЩОК) використовували хлорні екстракти тканин. Інкубаційна суміш (кінцевий об'єм 3 см3) містила трис НСl буфер (рН 7,66), НАДН (7мг : 1 см3 Н2О) та малатдегідрогеназу (МДГ)("Реанал", Угорщина). Вміст ЩОК виражали в мкмолях на 100 г сирої тканини [156].
Про вміст ?-кетоглутарату в хлорних екстрактах тканин судили за методом, описаним в роботі [133]. До складу інкубаційної суміші входили : фосфатний буфер (рН 7,60), НАДН (7 мг : 1 см3 Н2О) та глутаматдегідрогеназа (ГДГ)("Реанал", Угорщина). Вимірювання проводили на спектрофотометрі при довжині хвилі 340 нм. Вміст ?-кетоглутарату виражали в мкмоль на 100 г сирої тканини. Якщо ГДГ була в розчині аміаку, то його до фосфатного буферу не додавали.
Вміст малату в тканинах риб визначали спектрофотометрично [154] при довжині хвилі 340 нм., використовуючи при цьому їх хлорні екстракти. Інкубаційна суміш складалась із : гліцин-гідразинового буферу (рН 9,5), НАД+ (40 мг : 1 см3 Н2О) та МДГ. Загальний її об'єм становив 3 мл. Концентрацію малату виражали в мкмоль на 100 г сирої тканини.
Спочатку визначали вміст кетокислот (пірувату, ЩОК, і ?-кетоглутарату) в тканинах, а потім лактату і малату. Перед проведенням аналізів реактиви та екстракт тканин доводили до кімнатної температури.
Значення [НАД+]/[НАДH] в цитоплазмі клітин тканин розраховували за формулою [НАД+]/[НАДH] = 1 / КЛДГ ? [піруват] / [лактат], де КЛДГ - константа лактатдегідрогеназної системи. Вона дорівнює 0,