РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Матеріал дослідження
Матеріалом для даного дослідження послужили серця трьох об'єктів: курей, білих безпорідних щурів та людини. Серця ембріонів курей отримували згідно загальноприйнятим методикам інкубації [43], при використанні відповідних таблиць нормального розвитку ембріона курки за Hamburger і Hamilton (HH). Білих безпорідних щурів отримували з віварію ДДМА і утримували в звичайних умовах. Ембріональний матеріал експериментальних тварин отримували в лабораторних умовах відповідно до рекомендацій, викладених в довідково-методичному посібнику "Объекты биологии развития" [43], при використанні відповідних таблиць нормального розвитку. Матеріал ембріонів і плодів людини отримували з пологових будинків м. Дніпропетровська. Для визначення віку ембріонів і плодів проводили вимірювання тім'яно-куприкового і тім'яно-п'яточного розмірів, згідно рекомендацій Л.І.Фаліна [69]. Усього було досліджено 405 об'єктів. Розподіл матеріалу різних об'єктів за стадіями розвитку та термінами інкубації представлений у таблицях 2.1-2.3.
2.2. Методи дослідження
Відповідно до мети і задач дослідження був використаний комплекс методів гістологічного, імуногістохімічного, ультраструктурного, морфометричного, біометричного аналізу, а також комп'ютерне тривимірне моделювання компонентів перегородок серця вивчених об'єктів.
Інкубація. Метою інкубації було отримання курячих ембріонів з фіксованими термінами розвитку. Інкубацію проводили в лабораторних умовах за загальноприйнятими методиками. Вибірка і стандартизація термінів розвитку ембріонів здійснювалася за допомогою стандартних таблиць нормального розвитку за НН.
Таблиця 2.1
Кількісний розподіл матеріалу за строками онтогенетичного розвитку людини
Термін розвиткуКількість об'єктівЕмбріональний період5 тиждень106 тиждень108 тиждень10Плодовий період10 тиждень1012 тиждень10Усього50
Препарування. Метою цієї методики було одержання ембріонів на ранніх стадіях розвитку й ізольованих сердець ембріонів курки на більш пізніх термінах інкубації. Ембріони з терміном інкубації до 6 доби фіксувалися повністю, а усі більш пізні терміни розвитку ембріонів підлягали препаруванню, тобто серця ембріонів вилучалися і фіксувалися окремо.
Виготовлення серійних гістологічних зрізів, світлова мікроскопія (фарбування гематоксиліном-еозином, залізним гематоксиліном за Гейденгайном, альциановим синім, за Ван-Гізоном, за методом Маллорі-Слінченко). Метою даних методик було виявлення стадій утворення та редукції кардіогелю, дослідження мезенхімних клітин, щільності та утворення перших сполучнотканинних елементів.
Методика виготовлення гістотопографічних зрізів використовувалась нами тільки на самих ранніх стадіях розвитку (до 6 доби інкубації).
Таблиця 2.2
Кількісний розподіл матеріалу за строками онтогенетичного розвитку курки
Термін інкубаціїСтадія розвиткуКількість об'єктівПостінкубаційний період3,5 доба21104,5доба25155,5 доба28156 доба29157 доба31158-9 доба351011 доба371013 доба391015 доба411017 доба431019-20 доба451020-21 доба4610Новонароджені10Постінкубаційний період7 доба1014 доба1030 доба10Зрілі10Усього200
Вилучені ембріони фіксували рідиною Буена та заливали у парафін за загальноприйнятими методиками. Гістологічні та гістотопографічні зрізи робилися завтовшки від 5 мкм до 7 мкм на ротаційному мікротомі. Гістотопографічні зрізи демонстрували не тільки будову серцевих компонентів, а й також топографію великих судин, що виходять з серця, та давали уяву про взаємне співвідношення органів грудної клітки. Фарбування проводили за різними методиками. На ранніх стадіях розвитку фарбували зрізи альциановим синім, гематоксилін-еозином, залізним гематоксиліном Гейденгайна, а на більш пізніх проводили фарбування на знаходження сполучної тканини за Маллорі-Слінченком та Ван-Гізоном.
Таблиця 2.3
Кількісний розподіл матеріалу за строками онтогенетичного розвитку щура
Термін розвиткуКількість об'єктівПренатальний онтогенез11 доба1212 доба1513,5 доба1514,5 доба1516 доба1217 доба1219 доба1221 доба12Новонароджені10Постнатальний онтогенез7 доба1014 доба1030 доба10Зрілі10Усього155
Для вивчення тонких структур (ендотеліального вистелення, процесу епітеліо-мезенхімної трансформації, кардіогелю) та проведення кількісного морфологічного аналізу використовували напівтонкі та ультратонкі зрізи. Виготовлення зрізів проводили на ультрамікротомі УМТП-5 з блоків, залитих в епон-аралдіт або ловікрил.
Для виготовлення епонових блоків шматочки тканини об'ємом близько 1 мм3 фіксували в 2,5% розчині глютаральдегіда, виготовленому на 0,1 М фосфатному буфері (pH 7,4) протягом 2 годин при кімнатній температурі. Дофіксацію проводили 1% розчином чотирьохокису осмію на тому ж буфері протягом 2-х годин. Після зневоднення шматочки тканини заключали у суміш епону й аралдіту відповідно до рекомендацій [50, 68].
Підготовка препаратів для морфометричного аналізу включала фарбування отриманих напівтонких зрізів з використанням залізного гематоксиліна Гейденгайна за методом Kurotaki, викладеним в [50]. Для цього зрізи заздалегідь обробляли 2,5%-ним розчином залізоаміачних квасців протягом 6 хвилин при температурі +70?С і забарвлювали розчином Гейденгайна (0,5 г гематоксилина в 10 мл етанола і 90 мл дистильованої води) протягом 4 хвилин при температурі +80?C. Після промивки і висушування забарвлені зрізи брали в бальзам.
Для ультраструктурного дослідження використовували електронну мікроскопію. Для цього зрізи контрастували водним розчином уранілацетату і цитратом свинцю. Дослідження проводили на електронному мікроскопі ЕМВ-100Б при прискорюючій напрузі 75 кВ і первинних збільшеннях від 2000 до 25000. У цілому, електронно-мікроскопічне дослідження проводили за схемою, запропонованої В.Я.Карупу [28].
Оцінку ультраструктурних змін у міока