Розділ 2
Матеріали та методики
2.1 Експериментальна частина
Експериментальні дослідження виконані на базі відділу патоморфології та
патофізіології ІТО АМНУ (керівник ? проф. А.Т. Бруско) та лабораторії клінічної
біохімії НАН України (керівник ? канд. біол. наук. Л.І. Апуховська).
Робота проведена на 86 щурах ? самцях лінії Вістар масою 90±5г, на яких
моделювали аліментарний (46 щурів), та масою 300±5г, на яких моделювали
дисфункціональний (40 щурів) остеопороз. Тварини всіх серій до початку
дослідження знаходились на звичайному харчовому раціоні та утриманні. Утримання
та харчування тварин здійснювали відповідно до «Санітарних правил створення,
обладнання та утримання експериментально-біологічних клінік (віваріїв)» від
06.04.73 р. та доповнень від 04.12.78 р. до наказу МОЗ СРСР № 163 від 10.03.66
р. «Про добові норми харчування тварин та продуценти». У період акліматизації
(тиждень) і під час експерименту тварини знаходились у віварії при температурі
18?220 С, вологості 50-60 %, природньому світловому режимі “день-нічь” [21].
Підбір тварин та формування груп проводили за методом “випадкових чисел” [27,
56]. Дослідний препарат вводили один раз на добу внутрішньошлунково за
допомогою зонду у вигляді водної суспензії таблетованої маси у дозах 200 мг/кг,
виходячи з максимальних лікувальних добових доз та загального обміну речовин у
експериментальних тварин [41]. Об’єм дози препарату, що вводили, складав 0,1
мл.
Метою експерименту було визначити зміни метаболізму і порушення
структурно-функціонального стану кісткової тканини при аліментарному та
дисфункціональному остеопорозі та вплив комплексного препарату вітаміну D3 на
динаміку цих змін. Поставлено вісім серій дослідів.
Аліментарну модель остеопорозу створювали шляхом утримання тварин у звичайних
умовах віварію на D-гіповітамінознії дієті протягом 60 днів (перша серія, 10
щурів). Тварини другої серії, які знаходились у звичайних умовах віварію та
харчування протягом 60 днів, були контролем для першої серії (16 щурів). До
третьої серії увійшли тварини, які знаходились у звичайних умовах віварію і
після утримання протягом 60 днів на D3-гіповітамінозній дієті, на фоні
D-гіповітамінозу протягом 30 днів перорально додатково вводили 20 мг
комплексного препарату вітаміну D3 (10 щурів). Тварини четвертої серії, які
знаходились у звичайних умовах віварію та харчування протягом 90 днів, були
контролем для третьої серії (10 щурів).
Дисфункціональну модель остеопорозу отримували шляхом утримання тварин у стані
гіпокінезії за рахунок тісної клітки протягом 60 днів (п`ята серія, 10 щурів).
Тварини шостої серії знаходились у звичайних умовах віварію, як і тварини
п`ятої групи, на повноцінному раціоні харчування протягом 60 днів, були
контролем для п`ятої серії (10 щурів). До сьомої серії увійшли тварини, яких
утримували у стані гіпокінезії за рахунок тісної клітки протягом 60 днів, на
фоні гіпокінезії протягом 30 днів перорально додатково вводили 60 мг
комплексного препарату вітаміну D3 (10 щурів). Тварини восьмої серії, які
знаходились у звичайних умовах віварію та харчування протягом 90 днів, були
контролем для сьомої серії (10 щурів).
По закінченні терміну спостереження тварин зважували та під ефірним наркозом
виводили із досліду шляхом декапітації. Забирали кров, яку центрифугували при
3000 об./.хв. протягом 10 хв. і отримували сироватку.
Вміст загального кальцію визначали за допомогою біотестнаборів (Lachema). Метод
заснований на тому, що розчин гліоксаль-біс-(2-окси-аніла) утворює з кальцієм у
лужному середовищі комплекс червоного кольору, ступінь екстенції якої визначали
за допомогою спектрофотометра при Л = 540 нм, та розраховували у молях на літр
сироватки крові.
Вміст білковозв`язаного кальцію визначали на 0,1 мл сироватки крові, до якої
добавляли 1,0 мл 96% етанола. Розчин збовтували та залишали при кімнатній
температурі на 30 хв. потім центрифугували при 3000 об/мін на протязі 15 хв. до
появлення щільного осаду. Зливали надосадкову рідину. Підсушували осад на
водяній бані при 45-50є до видалення залишків етанолу. Осад розчиняли в 0,5 мл
0,4 М розчину NаОН та ставили на гідроліз на киплячу водяну баню на 10 хв.
Охолоджували до кімнатної температури. До отриманого гідролізату добавляли 1,0
мл бідистильованої води та розчин гідроокису натру 1 моль/л. Екстенцію
визначали між 5 та 15 хв. за допомогою спектрофотометру при Л = 540 нм та
розраховували в молях на літр сироватки крові.
Вміст ультрафільтруючого кальцію визначали за різницею між вмістом загального
кальцію та білковозв`язаного кальцію сироватки крові.
Вміст неорганічного фосфору ? визначали за Dyce [81]. Суть реакції полягає в
утворенні неорганічного фосфору з амонієм молібдату в присутності аскорбінової
кислоти в розчин блакитного кольору, екстенція якого відбувається при Л = 640
нм. Вміст неорганічного фосфору розраховували в ммоль на 1 л сироватки крові.
Активність загальної лужної фосфатази визначали за допомогою біотестнабору
(Lachema). В якості субстрату використовували 4-нітрофенілфосфат, який у
буферному середовищі під впливом ферменту розщеплюється на 4-нітрофенол та
ортофосфат. Активність ферменту розраховували по кількості 4-нітрофенолу, по
екстенції при Л = 405 нм. Активність ферменту виражали у О/л, де О – кількість
мкмолей 4-нітрофенолу, звільненого під впливом лужної фосфатази, яка міститься
в 1л сироватки крові за 1 хв. при умовах досліду.
Активність кишечної лужної фосфатази визначали подібно до визначення активності
загальної лужної фосфатази. Використовували такі самі реактиви. Крім того, до
складу реактивів додатково вводили 0,1 мл 5 мМ розчину L-фенілаланіну.
А
- Киев+380960830922