РАЗДЕЛ 2
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Постановка эксперимента
Работа выполнена на 96 крысах-самцах линии Вистар массой 180-200 г, возрастом 3-4 месяца.
Воспроизведение воспаления. В качестве модели хронического воспаления было выбрано карагиненовое асептическое гранулематозное воспаление. Под кожу спины животным вводили 8 мл стерильного воздуха. Через 24 часа в полученный подкожный мешок вводили 4 мл 2% раствора ?-карагинена в изотоническом растворе NaCl [198]. Раствор карагинена перед введением стерилизовали автоклавированием при 1210С в течение 15 мин. Все процедуры выполняли под эфирной анестезией. Сроки течения воспаления отсчитывали от момента введения флогогена.
Облучение. Для облучения использовали источник ?-излучения ОВ-6, Германия (рис. 2.1). Параметры источника облучения: радиоактивный изотоп - 137Cs, радиоактивность - 20 Ci, энергия фотонов - 660 кэВ. Для достижения заданных доз животные были размещены на расстоянии 1.6 м от источника, так что мощность дозы облучения составляла 21 мГр/ч. Такая интенсивность облучения соответствует радиационным условиям, в которых находились люди в местах ядерных катастроф. Животными были получены дозы 0.1, 0.5 и 1.0 Гр в течение 4.8, 24 и 48 часов соответственно. Доза в 0.1 Гр лежит в области т.н. малых доз (менее 0.2 Гр или 1 трек на ядро), считавшихся до недавнего времени относительно безопасными [199]. Доза в 1.0 Гр является классической радиобиологической дозой, эффекты которой хорошо изучены при остром облучении. Доза в 0.5 Гр находится в промежуточной области.
Рис. 2.1. Источник ?-излучения ОВ-6, Германия.
Животных первой серии облучали к 3-м суткам воспаления. Выведение их из эксперимента осуществляли декапитацией под эфирным наркозом сразу после облучения, т.е. на 3-и сутки, и на 7-е сутки воспаления.
Животных второй серии облучали к 7-м суткам. Выведение из эксперимента проводили сразу после облучения, т.е. на 7-е сутки, и на 14-е сутки воспаления.
Выбранные для облучения сроки хронического воспалительного процесса соответствуют пикам лимфоцитарно-макрофагальной реакции и развитию гиперплазии костного мозга при воспалении [63, 68, 198, 200-203]. Исходили из того, что радиационная чувствительность указанных клеток, вероятно, максимальна именно в эти сроки.
Кроме немедленного эффекта, представлял интерес отсроченный эффект низкоинтенсивного облучения.
Распределение животных по сериям и группам представлено в табл. 2.1.1.
Таблица 2.1.1.
Количество животныхДоза облучения,
ГрЖивотные, облученные к 3-м суткам воспаленияЖивотные, облученные к 7-м суткам воспаленияВыведение из эксперимента сразу после облученияВыведение из эксперимента на 7-е сутки воспаленияВыведение из эксперимента сразу после облученияВыведение из эксперимента на 14-е сутки воспаленияКонтроль (0 Гр)66660,166660,566661,06666Всего242424244848
Контролем служили животные, у которых вызвали воспаление, но облучению не подвергали.
Содержание животных и способ их умерщвления. Животные всех экспериментальных групп находились в одинаковых условиях, по 6 особей в стандартных металлических клетках, водный и пищевой режим - ad libitum. Для исключения влияния сезонных и суточных колебаний на изучаемые показатели основные исследования были проведены в осенне-зимний период, в утренние часы.
Все процедуры с животными, а также выведение животных из эксперимента путем декапитации проводили под анестезией с использованием диэтилового эфира в соответствии с национальными "Общими этическими принципами опытов на животных" (Украина, 2001), которые согласуются с положениями "Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей" (Страсбург, 18.03.1986 г.), а также Хельсинской декларацией, принятой Генеральной ассамблеей Всемирной медицинской ассоциации (1964-2000 гг.) и Уставом Украинской ассоциации по биоэтике и нормами GLP (1992 г.). Использовали минимально допустимое для статистической обработки и получения достоверных результатов общепринятое количество животных (по 6 на группу), а также минимально достаточное для достижения цели и решения задач исследования количество экспериментальных групп, т.е. общее количество животных.
В качестве материала для исследований использовали экссудат из гранулемы, костный мозг бедра и периферическую кровь.
2.2 Определение лейкоцитарной реакции очага хронического воспаления. О лейкоцитарной реакции очага воспаления судили на основании определения относительного количества гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов в экссудате, полученном из полости, образованной стенкой гранулемы, и их функциональной активности.
Подсчет относительного количества гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов в экссудате производили в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе [204].
О функциональном состоянии лейкоцитов судили по активности маркерных ферментов: миелопероксидазы (МПО) и кислой фосфатазы (КФ) в нейтрофилах, ?-нафтилацетат-эстеразы (?-НАЭ) в моноцитах и лимфоцитах [204] (см. ниже).
2.3. Определение состояния костномозгового кроветворения. Костномозговое кроветворение изучали путем подсчета общего количества кариоцитов (ОКК) в костном мозге бедра и клеточного состава костного мозга.
Для получения костного мозга выделяли бедренную кость крысы, очищали ее от мягких тканей и тщательно промывали канал 1 мл 3% уксусной кислоты (подкрашенной генцианвиолетом). Костный мозг суспендировали, набирали в меланжер для белой крови и разводили 3% уксусной кислотой. Подсчет ОКК осуществляли с помощью камеры Горяева [204].
Клеточный состав костного мозга исследовали путем подсчета миелограмм в мазках костного мозга из бедренной кости с последующим перерасчетом на абсолютное количество клеток на основании ОКК. Для приготовлен