РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Клінічні методи обстеження хворих на ЦІН, асоційованих з ВПЛ
З метою виконання поставлених завдань нами протягом 4-х років комплексно і в динаміці було обстежено 127 хворих на ЦІН І та ЦІН ІІ, індукованих ВПЛ. Жінок відбирали серед тих, що зверталися за консультацією з приводу патології ШМ на кафедру акушерства і гінекології №1 Національного медичного університету ім. акад. О. О. Богомольця (завідувач кафедри - член-кор. АМН, доктор медичних наук, професор Б.М. Венцківський), Центральну поліклініку МВС України та госпіталізованих у гінекологічне відділення клінічної лікарні №18 м. Києва. В залежності від ступеня тяжкості патологічного процесу всі хворі розподілені на 2 клінічні групи. 1-у клінічну групу склали 62 хворі на ЦІН І, 2-у клінічну групу склали 65 хворих на ЦІН ІІ, асоційовані з ВПЛ. Контрольну групу склали 30 здорових жінок. Всім хворим проведене комплексне параклінічне обстеження. У табл. 2.1.1 наведено відомості щодо методів, об'єктів і обсягу проведеного дослідження.
Таблиця 2.1
Методи і обсяг досліджень
Метод:
комплексне обстеження у динаміці:Об'єктОбсяг (кількість осіб)Хворі пацієнтки 127Здоровіпацієнтки30Кольпоскопічнийслизова оболонка ШМ127Цитологічнийшкребки з слизової оболонки ШМ127Гістологічнийбіопсійний матеріал127Молекулярно-біологічнийбіопсійний матеріал127ПЛРшкребки з слизової оболонки ШМ127Імунологічнийкров127
До комплексного аналізу обстеження хворих входило: вивчення анамнестичних даних щодо життя та хвороби пацієнток. Особлива увага приділялася виявленню запальних захворювань ШМ і додатків, наявності контактних кров'янистих виділень зі статевих шляхів, дискомфорту у піхві, висипань та больового синдрому. Підвищену увагу привертали жінки, які перенесли багато пологів і в анамнезі мали розриви ШМ. Проводився аналіз основних функцій жіночого організму: менструальної, статевої, репродуктивної. Привертали увагу дані щодо захворювань ШМ, з приводу яких робили біопсію, хімічну коагуляцію, кріодеструкцію, лазерну деструкцію та діатермокоагуляцію. Проводили соматичний огляд з метою виявлення гострих та підгострих форм патології органів і систем, діагностики онкологічних захворювань інших локалізацій; здійснювали візуальну оцінку стану зовнішніх статевих органів: визначали тип волосіння, ступінь розвитку зовнішніх статевих органів, а також наявність лейкоплакії, краурозу та кондиломатозних уражень аногенітальної ділянки.
Під час огляду в дзеркалах зверталася увага на наявність кондилом у ділянці вульви, вульварного кільця та стінок піхви, на розміри і форму ШМ, характер виділень із цервікального каналу, наявність старих розривів, поліпів, ерозій різних форм, ділянок лейкоплакії, дисплазії, макульозних змін слизової оболонки і наявного раку.
Проводилося бімануальне піхвове дослідження, за необхідності - ректовагінальне обстеження геніталій. Виконували обстеження за допомогою загально клінічних методів: реакція Вассермана, визначення антитіл до ВІЛ у крові, загальні аналізи крові і сечі. Бактеріологічно і бактеріоскопічно вивчали матеріал з цервікального каналу і піхви.
2.2. Кольпоскопічні дослідження
Кольпоскопічне дослідження здійснювали за методикою Л.М.Василевської (1988), використовуючи кольпоскоп фірми Zeiss із звичайними світлофільтрами при фронтальній відстані приблизно 225-250 мм і перемінною глибиною поля, що відповідає збільшенню у 12-22-40 разів. Аналізуючи отримані результати дотримувались термінології, запропонованої Є.В. Коханевич та співавт. (1997)
2.3. Цитологічні дослідження
Цитологічні препарати отримували у результаті щадного зешкрібу слизової оболонки ШМ, цервікального каналу та верхньобічного склепіння. Після нанесення матеріалу на предметне скло препарат сушили та фіксували в суміші Нікіфорова і фарбували за стандартною методикою по Папаніколау.
Оцінювали цитологічні препарати і ставили діагноз у лабораторії цитоморфології ЦНІЛ Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця (завідуюча кафедрою доктор медичних наук, професор Н.О. Колесова).
2.4. Гістологічні дослідження
Матеріалом для гістологічного дослідження слугував біопсійний матеріал, взятий із зони ураження ШМ. Його готували згідно із стандартною методикою з наступним фарбуванням препарату гематоксилін-еозином. Для виявлення ВПЛ- інфекції у діагностичному матеріалі використовували схему якісної оцінки препаратів, запропоновану А. Meisels (1981). Крім цитологічних ознак ПВІ враховували тканинні прояви ВПЛ- інфекції у вигляді акантозу, метаплазії, гіпер-, пара- та дискератозу поверхневих шарів епітелію.
Матеріал для досліджень підготовлювали та попередньо оцінювали в патологоанатомічному відділенні клінічної лікарні №18 м. Києва, остаточний діагноз формувався в лабораторії цитоморфології ЦНІЛ Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця.
2.5. Методика постановки полімеразної ланцюгової реакції
Дослідження виконано на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології Національного медичного університету ім. акад. О.О. Богомольця. Свіжий біопсій ний матеріал обробляли за допомогою ТВЕ-буфера і скляною паличкою перетирали зі скляною кришкою для здрібнювання тканин. Отримані зразки прогрівали у термостаті при 65 оС протягом 1 год і центрифугували при 5 тис обертів за хвилину упродовж 5-6 хв. Прозорий розчин відбирали і переносили у чисту пробірку типу Еппендорф. До нього додавали 30 мкл 5М перхлорату натрію, перемішували, після чого додавали рівний об'єм суміші (хлороформ: ізоаміловий спирт у співвідношенні 24:1 за об'ємом). Дану суміш струшували на вортексі 5 хв і центрифугували при 5-8 тис. об/хв. протягом 10 хв. Верхній водний шар ретельно відбирали у чисту пробірку. До одержаного розчину ДНК додавали 2,5 частини об'єму етилового спирту чи один об'єм ізопропілового спирту і добре перемішували, зал