РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования проводились в Институте проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Институте сцинтилляционных материалов НТК "Институт монокристаллов" НАН Украины, Харьковской государственной зооветеринарной академии МАП Украины.
2.1 Подготовка биологического материала.
Получение биоматериала. В качестве материала для исследований были использованы эякуляты следующих пород собак: немецкая овчарка, ротвейлер, восточноевропейская овчарка, лайка, среднеазиатская овчарка, беспородные. Эякуляты собак получали в стерильную лабораторную посуду при комнатной температуре (20оС) с помощью массажа предстательной железы в присутствии эстральной самки. Также использовался способ получения эякулята собак, разработанный в ходе наших исследований в Институте проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины [34]. Суть метода заключалась в том, что состояние эструса у самки иммитировалось с помощью многокомпонентной среды, которая воспринималась самцом как жидкость, выделяющаяся у самки из наружных половых органов в период эструса. Среду хранили в условиях жидкого азота и использовали следующим образом: в отдельной комнате на наружные половые органы самки наносили среду, которую предварительно размораживали на водяной бане при 40оС и разбавляли физиологическим раствором в соотношении 1:1. Для одной процедуры использовали 10 мл полученного раствора. Подготовленную таким образом самку подводили к самцу. После 10 мин знакомства собак и при отсутствии явной негативной реакции с помощью кинолога с использованием ручного массажа области предстательной железы получали эякулят. В экспериментах все фракции эякулята получали отдельно, что позволило избежать преждевременной активации сперматозоидов собак под воздействием третьей фракции, представляющей собой секрет предстательной железы [22].
Центрифугирование клеток. Центрифугирование эякулята собак с целью отделения сперматозоидов собак от плазмы производилась в пластиковых ампулах объемом 1 мл при 400 g в течение 3 мин.
2.2 Методы исследований
Определение рН, осмотичности эякулята. Объем эякулята измеряли в мерной пробирке, Реакцию среды (рН) и осмотичность эякулята определяли сразу же после получения спермы. Значение рН измеряли при помощи рН-метра Милливольтметр рН-121, осмотичность - с помощью осмометра ОМКА-1Ц-01.
Определение концентрации и подвижности спермиев. Микроскопические исследования проводили с помощью оптического микроскопа фирмы "Биолар" Польша, используя объективы х20, х40 и х90, окуляр х7 и х12. Концентрацию спермиев в эякуляте определяли при помощи фотоэлектроколориметра (КФК - 3). Для этого в пробирку наливали 3 мл Трис-НCl буфера ("Trizma"), (рН 7,2), и добавляли 0,1 мл эякулята, после чего перемешивали и переносили в кювету. По степени ослабления светового потока полученной суспензией спермиев определяли величину оптической плотности при Е690 (красный светофильтр). Для построения калибровочной кривой, отражающей зависимость оптической плотности от концентрации спермиев, эякулят центрифугировали и осадок ресуспендировали в 1 мл среды, содержащей 0,25 М Трис-НCl ("Trizma"), (рН 7,2). Чтобы получить различные концентрации спермиев делали серию разведений этой суспензии (1:10, 1:20, 1:30, и т.д). Затем в каждом эталоне определяли концентрацию спермиев в счётной камере Горяева (среднее из трёх измерений) и оптическую плотность. Зная фактическую концентрацию клеток и измеренную на ФЭКе оптическую плотность каждого образца, строили калибровочную кривую. Концентрацию спермиев выражали в млн. на 1 мл спермы. Оценку подвижности сперматозоидов собак осуществляли с помощью счетной камеры Горяева. Подвижность сперматозоидов вычисляли по формуле 2.1 и выражали в процентах:
М = А / S ? 100, где
М - подвижность сперматозоидов собак в процентах
- количество подвижных спермиев в определенном числе счетных квадратов;
- общее количество спермиев в том же количестве счетных квадратов.
Для дальнейших исследований отбирали эякуляты с поступательной подвижностью не менее 65 % в нативном эякуляте. Для серии экспериментов по определению влияния нативной и замороженно-оттаянной плазмы эякулята на подвижность криоконсервированных сперматозоидов собак отбирали эякуляты с начальной подвижностью 50, 60, 70, 80 %. Определение времени переживания спермиев на разных этапах криообработки проводили в процессе инкубации в открытых пробирках фирмы Ependorf при 37оС и при 4оС. Объем образцов составлял 0,5 -1,5 мл.
Методы криоконсервирования сперматозоидов собак.
Метод криоконсервирования сперматозоидов собак в открытых гранулах. В первой серии экспериментов полученный материал (первая и вторая фракция спермы) делили на 24 аликвоты по 200 мкл. Аликвоты 1-24 центрифугировали. Надосадок удаляли. Осадок сперматозоидов ресуспендировали следующими средами:
Среда 1 - трис-фруктозо-желточная (ТФЖ) - 0,25 М Трис - буфера; 0,05 М фруктозы; 20 % (v/v) желтка куриных яиц в соотношении 1:1.
Среда 2 - трис-глюкозо-желточная (ТГЖ) - 0,25 М Трис - буфера; 0,05 М глюкозы; 20 % (v/v) желтка куриных яиц в соотношении 1:1.
Среда 3 - трис-лактозо-желточная (ТЛЖ) - 0,25 М Трис - буфера; 0,025 М лактозы; 20 % (v/v) желтка куриных яиц в соотношении 1:1.
Среда 4 (ТФЖп) 0,5 М Трис - буфера; 0,1 М фруктозы; 40 % ( v/v) желтка куриных яиц.
Среда 5 (ТГЖп) 0,5 М Трис - буфера; 0,1 М глюкозы; 40 % ( v/v) желтка куриных яиц.
Среда 6 (ТЛЖп) 0,5 М Трис - буфера; 0,05 М лактозы; 40 % ( v/v) желтка куриных яиц.
После охлаждения суспензии сперматозоидов в открытых контейнерах в условиях холодильника в течение 10 мин до температуры 4оС в аликвоты 1-12 была добавлена в соотношении 1:1 вышеуказанная предварительно охлаждённая до 6оС среда с ГЛ или ЭГ. Конечная концентрация криопротекторов в суспензии сперматозоидов составила соответственно ГЛ - 3 % и 7 %, ЭГ - 3 % и 7 %.
2 мл среды ТФЖп, ТГЖп, ТЛЖп доводили до объема 4 мл составом, содержащим плазму 1 и 2-й фракций эякулята и дистиллированную воду в соотн
- Киев+380960830922