РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Згідно до мети та завдань роботи було досліджено біологічні зразки, отримані зі
слизових оболонок сечовивідних шляхів (зскребки з уретри), сеча та кров 270
чоловіків; зскребки з уретри, цервікального каналу, мазки з піхви, сеча та кров
630 жінок (900 обстежених хворих). Хворі були обстежені у клініці ДУ «Інститут
урології АМН України» лікарем-урологом вищої категорії, к.м.н. Мітченко М.В.,
лікарем-урологом вищої категорії Рудаковим В.О.; лікарем-гінекологом, зав.
відділенням акушерства та гінекології Київської Обласної лікарні МОЗУ, к.м.н.
Петрусенко В.П; лікарем-урологом вищої категорії Клінічної міської лікарні МОЗУ
№1 в м. Києві к.м.н. Кушніруком Ю.І. Клінічне обстеження включало ретельний
збір анамнестичних даних; огляд лікарем та мануальне обстеження;
загальноклінічні лабораторні дослідження; УЗД (лікар Гречаник О.І.). Додатково
хворі пройшли добровільне обстеження на наявність антитіл до ВІЛ у Київському
міському центрі ВІЛ/СНІДу МОЗУ.
Алгоритм дослідження біологічних зразків у лабораторії мікробіології,
вірусології та мікології ДУ «Інститут урології АМН України» наведено на рис.
2.1.
Для мікробіологічних досліджень використовували зразки сечі, мазки зі слизової
оболонки піхви, зскребки клітин зі слизових оболонок уретри та цервікального
каналу, секрет передміхурової залози та еякулят. Мікробіологічні дослідження
зразків патологічного матеріалу включали виділення на поживних середовищах та
ідентифікацію культур бактерій та дріжджових грибів за
культурально-ферментативними властивостями. Молікути (Mycoplasma hominis,
Ureaplasma urealyticum) виділяли як на селективних поживних середовищах
власного виготовлення [59,96], так і з використаннях комерційних тест-систем
Mycoplasma DUO, Biorad (Франція).
Зскребки клітин зі слизових оболонок досліджували також методом полімеразної
ланцюгової реакції (ПЛР). Специфічні нуклеотидні послідовності ДНК
C.trachomatis, M.hominis et genitalium, U.urealyticum, G.vaginalis,
N.gonnorhoeae, T.vaginalis, Human papillomavirus (low risk & high risk type),
Cytomegalovirus, Herpes simplex virus (type II) визначали з використанням
відповідних комерційних тест-систем, праймерів та обладнання виробництва фірм
«ДНК-технологія», «Біоком» та «Амплісенс», (РФ).
Ексфоліативні цитоморфологічні дослідження виконували методом світлової
мікроскопії. Препарати забарвлювали за Романовським-Гімза [8,122], та за
Папаніколау [122,123]. Для забарвлення використовували комерційні барвники:
азур-еозин за Романовським «Диахим-ГемиСтейн – Р» виробництва «Диахим», (РФ);
гематоксилін за Харрісом, OG6 (orange G), EA50 виробництва Merck, (Німеччина).
У цитологічних препаратах досліджували ознаки, що характеризують перебіг
запального процесу: тип та відносну кількість елементів запалення; тип та
характер розташування епітеліальних клітин; стан цитоплазми та ядер
епітеліоцитів. Оцінювали кількість слизу, клітинного детриту та наявність
фібринозних мас [122]. У зскребках визначали клітини з цитоплазматичними
включеннями, що характерні для хламідій; «ключові» клітини, що характерні для
гарднерел; трихомонади, гонококи та іншу мікрофлору.
Для детального цитоморфологічного аналізу було відібрано зразки зскребків,
отриманих від 105 чоловіків та 152 жінок, що мали підтвердження етіологічного
діагнозу за сукупністю лабораторних методів.
Сироватки крові всіх хворих тестували у імуноферментному аналізі (ІФА) на
присутність специфічних антитіл (IgG) до атигенів C.trachomatis, U.urealyticum,
M.hominis, Herpes simplex virus та Cytomegalovirus. В роботі використовували
комерційні тест-системи для ІФА виробництва «Orgenics»
(Ізраїль) та Вектор-Бест (РФ). Облік результатів виконували за допомогою
планшеточного рідеру Multiscan, «Labsystems», (Фінляндія).
Для вивчення показників місцевого імунітету було досліджено зразки (змиви),
отримані зі слизової оболонки піхви у 135 жінок, що мали підтвердження
етіологічного діагнозу за сукупністю лабораторних методів. Нами було розроблено
спеціальну методику виконання змивів зі слизової оболонки шийки матки та піхви
у жінок та з уретри у чоловіків. Алгоритм досліджень місцевого імунітету
наведено на рис. 2.2.
Змиви виконували 0,9% стерильним розчином NaCl до отримання зскребків, у об’ємі
3 мл. спеціальною піпеткою, з метою уникнення можливої контамінації зразків
кров’ю. Після ретельного перемішування змиви центрифугували при 1,5 тис. об/хв
протягом 20 хвилин та відбирали надосадкову рідину для дослідження показників
гуморальної ланки місцевого імунітету. У надосадковій рідині визначали такі
показники гуморальної ланки:
рівень секреторного IgA (sIgA) та загальних імуноглобулінів (IgM, IgG);
рівень лактоферину;
рівень лізоциму;
активність комплементу.
Рівень sIgA та інших класів імуноглобулінів визначали у твердофазному ІФА з
використанням тест-систем виробництва «Вектор-Бест», (РФ) та методом радіальної
імунодифузії (РІД) у гелі за Mancini et al., [177]. Метод РІД заснований на
реакції утворення нерозчинного комплексу імуноглобуліну зі специфічними до
нього антитілами у тонкому шарі агару. Утворений преципітат має форму візуально
видимого кільця, діаметр якого пропорційний логарифму концентрації
імуноглобуліну, що визначається [177]. У роботі використовували антисироватки
проти IgA – секреторного виробництва ЗАТ «Медицинская иммунология» (РФ),
антисироватки
діагностичні моноспецифічні проти IgA, IgM та IgG виробництва «НПО «Микроген»,
(РФ).
Рівень лізоциму (мурамідази) визначали біологічним методом за Zucker et al.
[66,184]. Принцип методу базується на здатності лізоциму біологіч
- Киев+380960830922