РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Робота виконана у відділенні проблем харчування та соматичних захворювань дітей
раннього віку (керівник - доктор медичних наук О.Г.Шадрін), відділенні
функціональної діагностики (керівник – професор І.С.Лук’янова), лабораторії
імунології (керівник – професор В.П.Чернишов) ДУ „Інститут педіатрії,
акушерства і гінекології АМН України” (директор – академік АМН України
Ю.Г.Антипкін), науково-дослідною групою хроматографії Науково-дослідного
лабораторного центру Національного медичного університету ім. акад. О.О.
Богомольця (завідувач – проф. О.М.Грабовий).
Для виконання поставлених завдань нами було обстежено 135 дітей віком від 6 міс
до 3-х років, в тому числі 30 практично здорових дітей та
105 хворих із затяжним перебігом діареї.
Під час встановлення діагнозу використовували «Унифицированные
клинико-статистические классификации заболеваний органов пищеварения»
(ведомственная инструкция утверждена МЗ Украины в 2004г.). Затяжною вважали
діарею з тривалістю захворювання понад 3 тижні [94]. Для верифікації діагнозу
дітям проводили лабораторно-інструментальне обстеження.
Стан слизової оболонки верхніх відділів ШКТ (стравохід, шлунок, дванадцятипала
кишка) за показаннями вивчали методом езофагогастродуоденоскопії, за допомогою
гастроінтестинальних фіброскопів фірми „Olympus” (Японія).
Ендоскопічне обстеження кишечнику в дітей раннього віку за показаннями
проводили класичним методом ректороманоскопії для виявлення патології нижніх
відділів кишечнику [27].
Вивчення морфології органів черевної порожнини (печінка, жовчний міхур,
підшлункова залоза, селезінка) проводили в усіх обстежених методом
ультразвукового дослідження за допомогою апарату „Aloka – 280” (Японія). Для
уточнення функціонального стану печінки вивчали білок-синтезуючу функцію
(протеїнограма), пігментну функцію (білірубін), активність органоспецифічних
ферментів (аланінамінотрансфереза, аспартатамінотрансфераза, лужна фосфатаза).
Зовнішньосекреторну функцію підшлункової залози оцінювали за рівнем
панкреатичних ферментів – амілази, ліпази, результатами копрологічного
дослідження. Біоптати слизової оболонки товстої кишки досліджували за допомогою
світлової мікроскопії.
Загальноклінічне обстеження включало оцінку фізичного та соматичного статусу
(маса тіла, зріст, сон, апетит), стан шкіри та слизових оболонок, кісткової
системи, внутрішніх органів, загальноклінічних аналізів крові і сечі, характеру
та частоти випорожнень, даних копрологічних досліджень.
Оцінку фізичного розвитку дітей проводили згідно з Наказом МОЗ України № 368
від 25.12.1998 р. “Про розробку регіональних стандартів фізичного розвитку
дітей”. Використовували антропометричний метод із застосуванням центильних
таблиць, в яких наведені дані про розподіл показників маси і довжини тіла,
індексу маси/довжини тіла за “центильними коридорами” в стандартній популяції.
Мікробіологічну діагностику проводили згідно з методами та вимогами наказу №
535 МОЗ СРСР від 22.04.1985 р. та наказу № 4 МОЗ України від 01.05.1996 р. За
допомогою бактеріологічних методів аналізували кількісний та видовий склад
мікрофлори кишечнику в дітей. Використовували розширений спектр селективних
бактеріологічних середовищ для виділення аеробних та анаеробних
мікроорганізмів: кров’яний агар, жовтково-сольовий агар, середовища Сабуро та
Ендо, тіогликолеве середовище, МRS, Блаурокка, кров’яно-телуритовий агар.
Підраховували кількість мікроорганізмів кожного виду окремо. Одержані
результати перераховували в десяткові логарифми залежно від кількості мікробних
клітин та обробляли методами статистики за Ст’юдентом.
Визначення вищих жирних кислот ліпідів сироватки крові проводили за
газохроматографічним принципом. Екстракцію ліпідів проводили наступним чином:
загальні ліпіди сироватки крові екстрагували 5 мл хлороформ-метаноловою сумішшю
(у співвідношенні 1:2) і витримували протягом 30 хвилин у холодильнику. Для
кращого розподілу фаз додавали 1 мл дистильованої води. Піпеткою Пастера
відбирали хлороформну нижню фазу. Для повної реакції етап екстракції
повторювали двічі. Об’єднані хлороформні екстракти концентрували випарюванням
до об’єму однієї краплі під струменем газоподібного азоту при 45оС на водяній
бані. До сухого осаду ліпідів додавали 5 мл 1% H2SO4 у метанолі і переносили в
скляну ампулу ємністю 10 мл. Після запаювання проводили гідроліз і метилювання
в термостаті при t-85оC протягом 20 хвилин. Екстракцію метильованих жирних
кислот ліпідів проводили двічі гексан-ефірною сумішшю (у співвідношенні 1:1) у
кількості 5 мл. Для розподілу фаз додавали 1 мл дистильованої води. Піпеткою
Пастера відбирали верхню фазу. Об’єднані екстракти випарювали досуха в потоці
азоту при t-45оC на водяній базі. Сухий осад розчиняли в 40-50 мкл чистого
гексану і вводили у випарювач хроматографа в кількості 5 мкл.
Газохроматографічний аналіз спектру жирних кислот ліпідів здійснювали на
газових хроматографах серії „Цвет-500” в ізотермічному режимі із
полум’яно-іонізуючим детектором за наступних умов: для визначення спектру
жирних кислот ліпідів використовували скляну колонку (розміри 3,0 м х0,3 см),
заповненої фазою 5% поліетиленгліколь сукцинату (ПЕГС) на хромотоні N-AW-HMDS
(зернування 0,125-0,160 мм), температура колонки – 180оC, температура
випарювача – 250оC, затрати азоту та водню - 35 мл/хв., затрати повітря – 200
мл/хв., швидкість діаграмної стрічки – 240 мм/год., чутливість шкали
підсилювача – 10-7 А, об’єм проби, що вводився – 3,0-5,0 мкл, тривалість
аналізу – 20 хвилин.
Кількісну оцінку спектру жирн
- Киев+380960830922