ГЛАВА 2
ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве субъекта исследования использовали препарат рекомбинантной
человеческой Cu-Zn СОД (СОДrec, рексод), полученной в ООО «РЭСБИО» (г.
С.-Петербург, РФ) из культуры штамма дрожжей – продуцентов Saccharomyces
cerevisiae Y 2134, полученных в ООО НПП "ТРИС" (г. Москва, РФ).
СОДrec представляет собой лиофильно высушенный белый порошок с голубоватым
оттенком, без запаха и вкуса, гигроскопичен, растворим в воде и этаноле.
Температура денатурации – 101°С. Активность СОДrec – 480 000 ед/мг белка (по
методу реакции окисления кверцетина). СОДrec содержит 0,96 мг/мг препарата
белка, стабильна в области рН 4,0-10,5. Срок хранения при температуре 0°-20° —
три года.
Эффективность СОДrec сравнивали с другими препаратами Cu-Zn СОД: эритроцитарной
человеческой Cu-Zn СОД – СОДer (фирмы “РЭСБИО”, г. Санкт-Петербург, Россия) и
препаратом СОД, полученным из печени крупного рогатого скота – пероксинормом
(фирма "Грюненталь", Германия). Активность СОД в препарате СОДer составляет 420
000 ед/ мг белка; пероксинорма – 460 000 ед/мг белка.
СОДrec, CОДer и пероксинорм вводили внутримышечно в ЕД50 – 0,020 мг/кг и 0,065
мг/кг, установленных ранее по антиоксидантной активности (% ингибирования
процессов СРО по критерию снижения уровня ТБК-активных продуктов). Помимо
этого, в качестве препаратов сравнения использовали классические антиоксиданты
– a- токоферола ацетат (препарат: витамин Е, производитель – ICN Октябрь,
Россия), эмоксипин (производитель Таллинский ХФЗ, Эстония) и рутозид (препарат:
кверцетин, производитель – Борщаговский ХФЗ, Украина). Токоферола ацетат
вводили внутримышечно в дозе 50 мг/кг, эмоксипин – в дозе 25 мг/кг, а кверцетин
– перорально в дозе 5 мг/кг (по данным литературы именно эти дозы являются EД50
по антиоксидантной активности) [34, 315, 317]. Выбор остальных препаратов
сравнения был обусловлен характером вызываемой патологии и требованиями ГФЦ МЗ
Украины по доклиническому изучению лекарственных средств [100]. Для
установления фармакологической активности СОДrec мы использовали следующую
схему опыта:
1 этап:
2 этап:
3 этап
Схема 2. Этапы фармакологического изучения рекомбинантной СОД
При изучении острой токсичности СОДrec использовали метод Т.В. Пастушенко и
соавт. [100]. Для этого было использовано 60 мышей массой 16-20г. Для изучения
фармакологической активности препаратов СОД были использованы методики,
утвержденные ГФЦ МЗ Украины [100].
Модели экспериментальных исследований препаратов СОД
Модель
Метод
Каррагениновый отек
0,1 мл 1% раствора каррагенина субплантарно
Зимозановий отек
0,1 мл 1% раствора зимозана субплантарно
Ватная гранулёма
Имплантация ватного шарика весом 20 мг подкожно
Адъювантний артрит
Субплантарное введение 0,1 мл адъюванта Фрейнда
Феноловый вульвовагинит
0,1 мл 5% фенола интравагинально в виде пены на протяжении 5 сут.
Уксусные язвы
Подкожно 0,5 мл 9% р-ра уксусной кислоты и одновременное введение в/брюшинно
р-ра 6% декстрана (300 мг/кг)
Иммобилизационный стресс
Иммобилизация на 3 ч. на спине
Изадриновый миокардит
Изадрин 60 мг/кг в/м на протяжении 4 суток
Адреналиновый миокардит
Адреналина гидрохлорид по 0,5 мг/кг в/в
Питуитриновий коронароспазм
Питуитрин 1 ЕД на животного в/брюшинно
Доксорубициновая кардиомопатия
Доксорубицин 20 мг/кг в/брюшинно
Алкоголь-фуразолидонова кардиомиопатия
Этанол в виде 25% раствора в/желудочно 5 г/кг + фуразолидон 200 мг/кг на
протяжении 10 недель
Гиперлипидемия
Холестерин в/желудочно на подсолнечном масле на протяжении 3 месяцев по 0,3
г/кг
Дитизоновый диабет
Дитизон в/брюшинно 35 мг/кг
Сосудистая проницаемость
Метод Голикова И.П.
Мембраностабилизирующяя активность
Метод Jager F.C.
Лучевое поражение
Облучение в дозах 5,8 Гр и7,5 Гр (мыши) та 6,2 Гр и 8,0 Гр (крысы)
В связи с тем, что в ранее проведенных исследованиях для СОДer было установлено
наличие нескольких ЕД50, нами проводилось установление ЕД50 для СОДrec. В
результате скрининговых исследований было установлено наличие у СОДrec
нескольких изоэффективных доз: 0,020 мг/кг (по антиоксидантной активности) и
0,065 мг/кг (по антицитолитической активности), что соответствует данным,
полученным для СОДer.
Наиболее универсальной реакцией живых систем на повреждение является
воспаление. Изучение противовоспалительных свойств препаратов СОД проводили на
моделях, характеризующих процессы альтерации, экссудациии и пролифирации. В
качестве препаратов сравнения помимо антиоксидантов мы использовали диклофенак
натрия (НПВС, обладающий антиоксидантной активностью) и индометацин [100,
196].
Антиэкссудативную активность препаратов СОД изучали на крысах-самцах линии
Вистар, у которых воспроизводили модель острого воспаления, индуцированного
субплантарным введением 0,1 мл 1% каррагенина и 1% зимозана [100, 196].
Изучаемые препараты вводили за 1 час до введения флогогенов [79]. Величину
отека в каждом случае определяли по разнице объема между отечной и здоровой
лапой. Противовоспалительную активность препаратов оценивали по способности
уменьшать развитие отека в сравнении с контролем и выражали в %, указывающих на
сколько исследуемый препарат угнетает развитие отека по отношению к контролю,
где величину отека принимали за 100%. Активность препаратов СОД и препаратов
сравнения рассчитывали по формуле:
(Мо -Мз) х 100
А = 100% - –––––––––––, где
Мок -Мзк
А - антиэкссудативная активность, %; Мо - объем отечной лапы в опыте;
Мз- объем здоровой лапы в опыте; Мок - объем отечной лапы в контроле;
Мзк- объем здоровой лапы в контроле.
В связи с тем, что в ранее проведенных исследованиях для эритроцитарной
человеческой СОД было устано