ГЛАВА 2 .
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ПРОВЕДЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Способ создания разгрузки задних конечностей и режимы подачи газовой смеси с пониженным Ро2
Исследования проведены на 120 белых крысах-самцах линии Вистар, массой 110-140 гр. Такая масса соответствует возрасту 1-1,5 мес. В это время скелет крыс находится в стадии быстрого роста. Как показали проведенные ранее исследования [129], молодая, растущая кость более чувствительна к различным внешним воздействиям, в том числе и к снижению весовой нагрузки, по сравнению со зрелой костью. Поэтому для исследования изменений биохимических и биофизических характеристик костной ткани использовали молодых животных.
Для создания безопорного положения задних конечностей животных вывешивали за хвост по методу, который был предложен Morey-Holton (1979) [119] при помощи специально сконструированного приспособления. Фиксация хвоста крысы в этом приспособлении осуществляется с помощью прижимных винтов с иглами. Анатомическое строение хвоста крысы позволяет прокалывать его мягкие ткани с латеральных сторон до упора в костную ткань, при этом не травмируя главные кровеносные магистрали и нервные волокна (рис.2.1). Животных вывешивали таким образом , чтобы задние конечности не касались основания клетки. При таком способе крепления животные могут свободно двигаться вокруг своей оси, потреблять пищу и воду, чиститься и умываться. Легко осуществлять ежедневный гигиенический уход за животными.
Рис2.1. Приспособление для щадящей фиксации хвоста крысы
На протяжении эксперимента крысы содержались по четыре под сферическим колпаком из оргстекла, в котором высверлены отверстия для вентиляции. Каждая крыса содержалась в индивидуальном отсеке (фото.1)
Было проведено три серии экспериментов продолжительностью 7, 14, и 28 суток соответственно. Крыс разделили на четыре группы. I группа - виварный контроль. II группа, крысы с разгрузкой задних конечностей, дышавшие атмосферным воздухом. III и IV группа - крысы с разгрузкой задних конечностей, вдыхавшие газовую смесь с пониженным Ро2 в режиме А и Б соответственно. В первой и второй серии экспериментов, продолжительностью 7 и 14 суток, в опыт брали только I и II группу животных. В третьей серии, продолжительностью 28 суток, эксперимент проводился со всеми четырьмя группами животных.
Распределение животных по группам, количество животных в каждой группе и условия содержания представлены в таблице 1.1
Таблица 1.1. Характеристика условий проведения экспериментов.
Продолжи-тельность экспериментаНомер группыКоличество животных в группе Условия содержания
7-сутокI
II 6
6виварийный контроль
разгрузка задних конечностей в атмосфере воздуха
14-сутокI
II10
10виварийный контроль
разгрузка задних конечностей в атмосфере воздуха
28-сутокI
II
III
IV29
26
13
15виварийный контроль
разгрузка задних конечностей в атмосфере воздуха
разгрузка задних конечностей с подачей ГС в режиме А
разгрузка задних конечностей с подачей ГС в режиме Б
Гипоксическая газовая смесь, которую подавали животным III, IV группы имела концентрацию кислорода 12-14 %, при нормальном атмосферном давлении. Такая концентрация кислорода соответствует высоте 3-3,5 тыс. м. над уровнем моря, т.е. среднегорью. Нами была выбрана прерывистая схема подачи гипоксической газовой смеси. Поскольку известно, что повышение общей неспецифической резистентности организма существенно ускоряется в случае когда общая доза гипоксического воздействия разделяется на несколько отдельных периодов гипоксической экспозиции, совершаемых повторно, через определенные периоды нормобарической респирации [40]. При использовании метода прерывистой гипоксии существует возможность широкого варьирования силы и продолжительности гипоксического стимула, а так же продолжительности пауз нормобарической респирации и общего времени экспозиции к гипоксии. В опытах на спортсменах [41] показано, что прерывистая гипоксия вызывает более выраженные изменения в показателях аэробного обмена и кислотно-щелочного равновесия крови, чем непрерывное гипоксическое воздействие.
Исследовали 2 различных режима подачи газовой смеси: при режиме А- газовую смесь подавали по 8 часов в сутки ежедневно, в режиме: 20 минут гипоксическая газовая смесь, 20 минут атмосферный воздух, при режиме Б -газовую смесь подавали по 8 часов в сутки в режиме: 30 минут гипоксическая газовая смесь, 20 минут атмосферный воздух. Подача гипоксической газовой смеси осуществлялась с помощью аппарата горного воздуха "Борей". Газовая смесь в этом аппарате создается с помощью газоразделительных элементов, работающих по принципу молекулярного сита. Компрессор подает на мембранный газоразделительный элемент атмосферный воздух. Молекулы кислорода в силу высокой растворимости в полимере интенсивно проникают через мембраны и отводятся из системы. Проходящий поток воздуха обедняется по кислороду тем больше, чем меньше расход и выше давление в системе. Это позволяет регулировать Ро2 в выходящей газовой смеси.
Во время всех серий экспериментов еженедельно контролировали вес крыс. Взвешивание крыс проводили натощак на технических весах с точностью до 0,5 г. Воду и еду животные получали без ограничений.
По окончании срока эксперимента всех крыс высаживали на 24 часа в специальные метаболические клетки, для сбора мочи и фекалий [93]. На следующие сутки животных декапитировали под рауш наркозом.
2.2 Методы измерения биофизических свойств костной ткани.
Для исследования изменений происходящих в костной системе под влиянием разгрузки задних конечностей, была выбрана бедренная и большеберцовая кости, поскольку остеодистрофия наиболее быстро развивается в костях несущих весовую нагрузку тела [78].
Выделенные и очищенные бедренные кости обезжиривали и обезвоживали в спирт:эфире (3:1). Массу и объем костей определяли путем взвешивания целых бедренных костей в дистиллированной воде и на воздухе. Объем образцов рассчиты