РОЗДІЛ 2
МЕТОДИ ТА ОБ'ЄКТ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Відбір тварин для дослідження
Досліди виконані на білих статево дозрілих безпородних щурах-самцях масою тіла 150-180 г, які утримувалися на стандартному раціоні віварію. В процесі роботи використано 362 тварини.
Моделями токсичного ураження печінки служила інтоксикація тварин солянокислим гідразином, який вводили щурам внутрішньоочеревинно одноразово у вигляді 6 % водного розчину в дозі 56 мг/кг [46], та комбіноване ураження гідразином та етиловим спиртом, котрий вводили за 3 год до ін'єкції гідразину внутрішньошлунково в дозі 12,5 мл/кг у вигляді 40 % розчину [205]. Тварин декапітували під легким ефірним наркозом через 24 год, 3 та 7 діб з моменту уведення солянокислого гідразину.
Для дослідження брали цільну кров, плазму крові, сироватку крові, гомогенат печінки, мікросоми, мітохондрії та лізосоми гепатоцитів. Всі піддослідні тварини були поділені на такі групи: 1- інтактні щури; 2 - уражені солянокислим гідразином, 3 - уражені солянокислим гідразином та етиловим спиртом; 4 - корекція прополісом; 5 - корекція холінфосфатидними ліпосомами з інкорпорованим токоферолу ацетатом; 6 - корекція ентеросорбентом полісорб; 7 - корекція за допомогою комбінації прополіс+ліпосми+полісорб.
Прополіс вводили з розрахунку 0,25 г/кг маси тіла тварини у вигляді 10 % спиртового розчину внутрішньошлунково одночасно з введенням солянокислого гідразину та етилового спирту (дозу якого зменшували на ту, яка вводилась разом з прополісом) протягом усього експерименту щоденно одноразово [131].
Суспензію холінфосфатидних ліпосом вводили внутрішньоочеревинно щоденно одноразово в дозі 100 мг/кг протягом усього експерименту [141].
Ентеросорбент полісорб вводили внутрішньошлунково із розрахунку 1 г/кг маси тіла через 1 год після введення солянокислого гідразину та етилового спирту щоденно протягом усього експерименту [176].
Експерименти на тваринах проводили у відповідності з "Правилами використання лабораторних експериментальних тварин".
2.2. Дослідження процесів ПОЛ та стану АОС
Визначення інтенсивності спонтанної та ініційованої Н2О2 хемілюмінесценції. Для реєстрації спонтанного надслабкого випромінювання ми використовували квантометричну установку, детектором в якій служив фотоелектронний помножувач ФЕП-39А, термостатований при 15 оС.
Інтенсивнiсть ХЛ визначали при температурi 37 оС. Як блок iндикацiї використовувався електронно-обчислювальний пристрiй ПР-14М, за допомогою якого можна отримувати цифрову iнформацію в iмпульсах за певний час, а також вести графiчне вiдображення процесу на самописцi КСП-4. Перед i пiсля кожного дослiдження перевiряли фон установки. Інтенсивнiсть спонтанної хемілюмінесценції визначали таким чином: у термостатовану кювету вносили 4,5 мл фосфатного буферу (рН = 7,4), молярна концентрація якого становила 0,02 моль/л, додавали 0,5 мл плазми кровi (без ознак гемолiзу) або гомогенату печiнки (1 : 10, на iзотонiчному розчинi натрію хлориду) i записували рiвень свiтiння [59]. Iнтенсивнiсть спонтанної хемілюмінесценції (СХЛ10) виражали в кiлькостi iмпульсiв за секунду (iмп/с).
Для пiдвищення iнформативностi методу використовували iнiцiювання ХЛ перекисом водню за методом [132]. Дослiдження проводили в такiй послiдовностi: реєстрували СХЛ, як описано вище; в кювету вносили 0,5 мл 3 % розчину перекису водню i реєстрували динамiку iнтенсивностi випромiнювання на самописцi до виходу кривої свiтiння на стацiонарний рiвень. Одночасно фiксували свiтлосуму iнiцiйованої хемілюмінесценції (СІХЛ200), яку виражали в імп/с. Амплiтуду спалаху ініційованої хемілюмінесценції (АІХЛ) після введення Н2О2 визначали шляхом вимiрювання вiдстанi вiд рiвня фону до верхнього рiвня свiтiння i виражали в умовних одиницях. Визначали також коефiцiєнт стимулювання ХЛ (К) перекисом водню, як частку вiд дiлення АІХЛ на амплiтуду СХЛ.
Визначення активностi супероксиддисмутази (СОД). Активнiсть СОД визначали за методом [170]. Для дослiдження брали 1 мл 10 % гомогенату печiнки, приготовленого на фосфатному буферi (рН=7,4). Проводили попередню обробку дослiджуваного матерiалу хлороформ-спиртовою сумiшшю i КН2РО4 з наступним центрифугуванням при 12000 об/хв протягом 15 хв при 4 оС. До 0,2 мл супернатанту додавали 1,3 мл фосфатного буферу (рН = 8,3), молярна концентрація якого 0,1 моль/л, 1 мл розчину нiтротетразолiю синього, 0,3 мл розчину феназинметасульфату i 2 мл розчину НАДН2, молярна концентрація якого 0,2 ммоль/л. Проби 10 хв витримували в темнотi й фотометрували (СФ-46, 540 нм) в 1 см кюветi проти проб, до яких не додавали НАДН2. Контролем служили проби, в яких замiсть гомогенату знаходилося 0,2 мл фосфатного буферу. Про активнiсть ферменту судили за його здатнiстю iнгiбувати вiдновлення нiтротетразолiю синього. Відсоток iнгiбування розраховували за формулою:
А=(Ек - Ед) х 100/Ек, (2.1)
де А - відсоток інгібування; Ек - екстинкцiя контрольної проби; Ед - екстинкцiя дослiдної проби. Кiлькiсть ферменту, який здатний iнгiбувати вiдновлення нiтротетразолiю синього на 50 %, приймали за 1 ум. од. активностi.
Визначення активності каталази (КТ). Активнiсть каталази визначали за методом [88]. Принцип методу полягає у здатностi перекису водню утворювати з молiбдатом амонiю стiйкий забарвлений комплекс.
Дослiджували плазму кровi i тканину печiнки, з якої на холодi готували 10 % гомогенат на трiс-буферi (рН = 7,8), молярна концентрація якого 0,05 моль/л. Реакцiю запускали додаванням 0,1 мл плазми або гомогенату до 2 мл 0,03 % розчину перекису водню. Паралельно готували холосту пробу, в яку замiсть дослiджуваного матерiалу вносили 0,1 мл дистильованої води. Через 10 хв реакцiю зупиняли додаванням 1 мл 4 % молiбдату амонiю. Інтенсивнiсть забарвлення вимiрювали на спектрофотометрi СФ-46 при 410 нм проти к
- Київ+380960830922