Розділ 2
Матеріали та методи досліджень
Експериментальна частина роботи проводилась на базі Інституту ветеринарної
медицини УААН в лабораторії вірусології, базі лабораторії біотехнології та
імунних препаратів крові Інституту гематології та трансфузіології АМН України,
в лабораторії гістології кафедри патанатомії Національного аграрного
університету, в лабораторії біотехнології та фітопатології Інституту
сільськогосподарської мікробіології УААН м. Чернігів.
2.1. Матеріали :
В роботі були використані такі матеріали:
Еталонні штами вірусу інфекційної анемії коней: штам вірусу інфекційної анемії
коней в Японії – EIA P 337 V 26 13 Aug 12. 1990, адаптований до культури клітин
ембріону коней, наданий професором ХірозоіСензукі 23 лютого 1995; та штам
Wyoming W 40 надісланий зі штату Айова професором Сюзен Карпентер 21 серпня
1995 року.
польові ізоляти вірусу інфекційної анемії:
З 14261/97 – виділений 7.06.1997 року з сироватки крові коня колгоспу “Зоря”
Черкаської області. Адаптований до культури лейкоцитів коня з титром 4,6 lg ТЦД
50/0,5 см3 на рівні 10 пасажу.
С 14378/98 – виділений 12.12. 1998 року, із сироватки крові лошати на Сумській
біофабриці. Адаптований до культури лейкоцитів коня з титром 5,6 lg ТЦД 50/0,5
см3 на рівні 6 пасажу.
Ч 17714 /01 – виділений 07.06 .2001 року із сироватки крові коня господарства
“Дубіївка” Черкаської області. Адаптований до культури лейкоцитів коня з титром
4,3 lg ТЦД 50/0,5 см3 на рівні 8 пасажу.
антигени – «Антиген и антисыворотка для диагностики инфекционной анемии
лошадей в РДП» Щолківського біокомбінату ТУ 46-21-379-77.
- позитивна специфічна сироватка до вірусу ІНАН для реакції непрямої
імунофлюоресценції – positive control serum (catalog No. 211-P-EIA) фірми WMRD,
Inc (США).
- антивидові імуноглобуліни кон’говані з ФІТЦ - FITC anti-immunoglobulin
conjugate (catalog No.: 043-AP-1) фірми WMRD, Inc(США)..
- негативну контрольну сироватку крові коней.
- флуоресцеїнізотіоціанат ( ФІТЦ) – FITC- FW 3894, F –3651, lot 79H 5070,
виробник фірма “Sigma”.
- фітогемаглютинін (ФГА) -PHITOHAMAGGLUTININ M, кат.№5030, фірми «Seromed®» ,
Німеччина.
нативні сироватки крові коней, всього 183 зразки отримували від коней
Київського державного іподрому, ТОВ “Магнат” селище Чубинське Бориспільський
район Київська область. Кров відбирали з яремної вени. Після її зсідання
сироватку збирали в стерильні флакони і зберігали в умовах холодильника
(+40С).
Необхідні реактиви “ЧДА” і дистильована вода, рН всіх розчинів вимірювали за
допомогою рН метру.
- Забуферений гліцерин. Гліцерин змішували фосфатним буфером у співвідношенні
9:1 (рН 7,4)
- Ацетон для фіксації клітин.
- Мазки-відбитки з різних органів хворих на ІНАН коней.
- NaCl, 0,15 М (8,8 г на 1 л).
- Мазки-відбитки з різних органів хворих на ринопневмонію, грип, енцефаломієліт
коней.
- Мазки-відбитки з різних органів здорових коней.
- Фіксовані препарати культури лейкоцитів здорового коня.
- Фіксовані препарати культури лейкоцитів коня зараженої вірусом ІНАН.
- Хімічні склянки для фіксації та відмивання препаратів від надлишку мічених
імуноглобулінів.
- Фіксовані препарати культури клітин заражені вірусом ринопневмонії коней.
- Фосфатно-буферний розчин (рН-7,2) готували за такою схемою:
* Na2HPO4 - 1,19 гр
* NaH2PO4 - 0,22 гр
* NaCl - 8,55 гр
* H2O(дист.) - до 1 літра.
- Нефлуоресціюючу імерсійну олію.
- Глобуліни імунної сироватки до вірусу ІНАН.
- Глобуліни імунної сироватки до вірусу ІНАН кон’юговані з ФІТЦ.
- Антивидові -g- глобуліни кон’юговані з ФІТЦ.
- Синька Еванса в концентрації 1:2000 (для контрастування).
- Порошок тканини, висушеної ацетоном. Тканину (переважно печінку) змішували з
рівним об’ємом 0,15 М розчину NaCl і суспензію гомогенізували в електричному
гомогенізаторі, отриманий гомогенат змішували в чотирьох об’ємам ацетону. Суміш
інкубували при кімнатній температурі, доки тканина не випаде у осад, після чого
надосадову рідину зливали, а осад за допомогою центрифугування, декілька раз
промивали 0,15 М розчином NaCl, для того щоб видалити увесь гемоглобін. Після
чого осад суспендували в рівному об’ємі 0,15 М розчині NaCl і до суспензії
додають 4 об’єми ацетону. Коли тканина осяде, надосадову рідину зливали, осад
суспендували в 4 об’ємах ацетону і суспензію фільтрували через фільтрувальний
папір, використовуючи лійку Бюхнера. Осад, не видаляючи із лійки, промивали в
чотирьох об’ємах чистого ацетону. Отриманий порошок висушували при 37 0С; його
можна зберігати в холодильнику до використання.
- Магнітна мішалка з зовнішнім реостатом (для попередження нагрівання).
- Волога камера для фарбування клітин флуоресціюючими антитілами.
- Накривні скельця розміром 18х18.
- Предметні скельця товщиною від 0,97 до 1,07 мм.
- Ванночки для промивання фарбованих препаратів.
- Люмінесцентний мікроскоп ”Люмам”. Оптика: використовували об’єктив з великою
апертурою. Для об’єктиву х25 апертура була 0, 6, для об’єктиву х40 - більше
0,95. Для зменшення флуоресценції фону використовували конденсор темного поля з
масляною імерсією. Джерелом світла слугувала ртутна лампа типу ДРШ-250 . В
люмінесцентному мікроскопі використовували систему світлофільтрів для виділення
синьо-фіолетової частини спектру ( ФС-1,СС –15-2), теплозахисні фільтри для
збереження оптики від перегрівання і вицвітання препаратів (СЗС-14, СЗС-7)
кювета з дистильованою водою, і запираючий фільтр, який встановлювали на
окулярі; він знімав збуджуюче випромінювання і пропускав люмінесцентне
випромінювання.
- термостати на 24оС, на 33оС та на 36оС.
- центрифуга на 1 000 об/хвилину (типу ОПН-3УХЛ 4.2).
- холодильник на 2-4оС.
- морозильні камери на -18-20оС та на -75оС.
- .
Під час виконання роботи викори
- Київ+380960830922