Вы здесь

Вивчення методом сайт-направленого мутагенезу елементів впізнавання тирозинової тРНК тирозил-тРНК синтетазою з вищих еукаріотів

Автор: 
Найдьонов Валерій Георгійович
Тип работы: 
Дис. канд. наук
Год: 
2002
Артикул:
0402U001969
99 грн
(320 руб)
Добавить в корзину

Содержимое

ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
В работе использовались следующие реактивы: акриламид, N,N-метилен-бис-акриламид, трис, формамид, ЕДТА, SDS, фенол, хлороформ ("Sigma", США); дезоксинуклеозид-трифрсфаты ("USB" США); рибонуклеозид-трифосфаты ("Epicentre", США и "Fermentas", Литва); суммарная тРНК из дрожжей ("Boehringer", Германия); ампициллин и тетрациклин (ПО "Дарница", Киев, Украина); неорганические соли квалификации не ниже "хч".
Олигонуклеотиды были синтезированные ВНИИ Генетики (Москва, Россия) и "Genosys" (США).
В процедурах молекулярного клонирования применялись рестриктазы производства "Fermentas" (Литва); Т4-полинуклеотид киназа и Т4 ДНК-лигаза ("New England Biolabs", США); Taq ДНК полимераза и Pfu ДНК полимераза (Stratagene, США); набор "Ready-to-Go T4 DNA ligase" ("Amersham-Pharmacia Biotech", Англия), нуклеазa S1 ("Worthington", США)
Для секвенирования ДНК использовали ?[32P]dATP ("Amersham", Англия) и набор "T7 Seguenase v.2.0. DNA seguencing Kit" (USB, США).
Для аффинной очистки рекомбинантных белков применяли Ni-NTA Agarose ("Qiagen", Германия) и Glutathione-Sepharoze 4B ("Amersham-Pharmacia Biotech", Англия).
[14C] тирозин (удельная активность 13320 МБк/ммоль) - производства Института по исследованию, производству и применению радиоактивных изотопов, Чехия.
В работе использовались клетки E. coli штаммов:
XL1-Blue: recA1, endA1, gyrA96,thi-1,hsdR17, supE44, relA1, lac, [F' proAB, lacIq, ZDM15,Tn10(tetr)];
BL21(DE3): F-, ompT, hsdS (rB- mB-), gal, dcm, (DE3)
CJ236: dut1, ung1,thi1, relA1/pCJ105(Cmr);
UT152: ara, tyrS565(ts), zdh-603::Tn10, gyrA, argE thi, ?pro-lac, rifR
2.2. Методы исследования
2.2.1. Конструирование искусственного гена тРНКTyr быка
Очистка олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды очищали при помощи електрофореза в пластине полиакриламидного геля (16х16х0,15 см), который имел состав: 19% (вес/объем) акриламида, 1% N,N-метилен-бис-акриламида, 8М мочевины, 50 mM трис-боратного буфера, рН 8.3. Для полимеризации геля добавляли ТЕMED и персульфат амония до конечной концентрации 0,05% каждого.
Олигонуклеотиды растворяли в 90% формамиде с 0,02% бромфенолового синего и наносили на гель в количестве 30 мкг на 1 см2 сечения геля. Електрофорез проводили при постоянном напряжении 800V до выхода маркерного красителя из геля. После завершения електрофореза гель переносили на пластину "Silufol" и вырезали зоны, которые содержали олигонуклеотиды необходимого размера, при облучении ультрафиолетовым светом (265 нм).
Элюция олигонуклеотидов осуществлялась в течении 18 часов при комнатной температуре буфером: 50 mM трис-HCl, pH 7.0; 300 mM NaCl; 10 mM ЕДТА.
К елюату добавляли ацетон до конечной концентрации 90% (объем/объем) и LiClO4 до конечной концентрации 20 mM, выдерживали 30-60 мин при температуре -20? С, и осаждали олигонуклеотиды центрифугированием в течение 15 мин при 16 000g.
Осадок промывали 70% этанолом, высушивали в вакууме и растворяли очищеные олигонуклеотиды в деионизованной воде.

Фосфорилирование олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды фосфорилировали при помощи Т4-полинуклеотид киназы в реакционной смеси, содержащей в объеме 50 мкл: 1 мкМ олигонуклеотида; 10 мкМ АТР Na; 66 мМ трис-ацетатный буфер, рН 7.9; 6,6 мМ Mg(CH3 COO)2; 137 мМ K(CH3 COO) и 20 единиц активности Т4 полинуклеотид киназы.
Реакционные смеси инкубировали в течение 45 мин при 37?С. Реакцию останавливали добавлением ЕДТА до конечной концентрации 20 мМ.
Проводили фенольную депротеинизацию и осаждали фосфорилированные олигонуклеотиды этанолом в присутствии 10 мкг гликогена. После центрифугирования при 16 000g в течение 15 мин осадок промывали 75%-ным этанолом и растворяли олигонуклеотиды в деионизованной воде.

Лигирование олигонуклеотидов. Фосфорилированные олигонуклеотиды гибридизовались в 8 мкл буфера: 10 мМ tris-HCl, pH 7,0; 100 mM NaCl. Вначале эквимолярная смесь олигонуклеотидов прогревалась при 90?С в течение 3 минут, затем медленно (в течение 30 минут)охлаждалась до комнатной температуры.
Реакцию лигирования олигонуклеотидов проводили с использованием набора "Ready-to-Go T4 DNA ligase" в соответствии с инструкцией производителя. Продукты лигирования после фенольной депротеинизации переосаждались этанолом.

Очистка искусственного гена TРНК Tyr быка. Продукт лигирования олигонуклеотидов длиной 104 пар оснований был очищен от несшитых олигонуклеотидов при помощи препаративного электрофореза в 2%-ном агарозном геле, приготовленном на буфере: 40 мМ трис-ацетат, рН 8.3.
После окраски геля бромистым этидием зона геля, которая содержала целевой фрагмент ДНК была вырезана, быстро заморожена при -70?С, разморожена при комнатной температуре и центрифугирована через слой стекляной ваты. Элюат экстрагировали равным объемом хлороформа и фрагмент ДНК из водной фазы осаждали этанолом.

Клонирование искусственного гена TРНКTyr быка в плазмиду pUC119.
Фрагмент ДНК, очищенный в агарозном геле и плазмида pUC119 были обработаны рестриктазами EcoRI и BamHI в реакционной смеси, содержавшей в объеме 100 мкл: 1 мкг плазмиды (или 300 нг фрагмента ДНК, кодирующего искусственный ген); 10 мМ трис-НСl рН 8.5; 10 мМ MgCl2; 100 мM KCl; 0,1 мг/мл БСА; 10 единиц активности рестриктазы EcoRI; 10 единиц активности рестриктазы BamHI.
После инкубации при 37?С в течение 2 часов реакционная смесь была депротеинизована фенольной экстракцией, ДНК осаждалась этанолом.
Реакцию лигирования искусственного гена тРНКTyr с плазмидой проводили в течение 16 часов при тепературе 16?С в 10 мкл буфера: 40 mM трис-HCl, pH 7,8; 10 mM MgCl2; 10 mM DTT; 0,5 mM ATP. Реакционная смесь содержала 2 единицы активности (Weiss) Т4 ДНК-лигазы.
Реакционной смесь после прогрева в течение 10 минут при 65?С использовалась для трансформации клеток E.coli штамма XL-1 Blue (Stratagene, США).
Компетентные клетки получали