РОЗДІЛ 2
ОБ'ЄКТ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Характеристика експерименту
Експериментальне дослідження проведено на 104 білих статевозрілих безпородних щурах-самках масою 220-290 г. Ці тварини відрізняються від іших невеликим життєвим циклом, безперервним ростом, швидкість обмінних реакцій в яких у 30 разів більша, ніж у людини, що дає можливість порівняти один день життя білих щурів з 1 місяцем життя людини. Крім того, білі щурі порівняно легко пристосовуються до фізичних навантажень [34, 78]. Вищенаведені факти дозволяють використовувати даних тварин для моделювання певних станів у кістковій системі, зокрема стану остеопорозу, вивчення різних режимів рухової активності та впливу фармакотерапевтичних засобів на ріст та якісний склад кісток скелета.
Експериментальна модель остеопорозу була створена на основі штучного порушення гормонального гомеостазу шляхом видалення у самки одного або двох яєчників (деклараційний патент на винахід 47677 UA, МКИ G09В23/28 "Спосіб моделювання остеопорозу") [26].
Динамічні фізичні навантаження моделювали шляхом бігу тварин у третбані конструкції Ю.Г. Ласія та Я.І. Федонюка (1981). Дозування навантажень здійснювалося шляхом встановлення різної його тривалості. Тривалість бігу при помірних динамічних навантаженнях становила в 1-й день дослідження 5 хвилин та збільшувалась на 1 хвилину в кожен наступний день. При інтенсивних динамічних навантаженнях тривалість бігу зростала на 5 хвилин щоденно протягом місяця при вихідному п'ятихвилинному терміні бігу.
Для експерименту використовували тварин з пятимісячного віку. Тварини розподілені на такі серії. У першій серії тваринам групи Б була проведена двобічна оваріектомія, після чого їх утримували у звичайних умовах віварію протягом 2 тижнів. Друга, третя та четверта серія тварин, групи Б, зазнали аналогічного хірургічного втручання, після чого виводились з експерименту через 4, 6 і 10 тижнів відповідно. П'ята серія тварин - це тварини, яких через 6 тижнів після проведеної оваріектомії піддавали впливу помірних динамічних навантажень протягом 1 місяця. Шоста серія - тварини, які 6 тижнів знаходились в умовах реадаптації після оваріектомії і після того отримували інтенсивні динамічні фізичні навантаження впродовж 1 місяця. Тварини сьомої серії на фоні помірних динамічних фізичних навантажень отримували препарат сандокал-Д (Novartis Pharma) у дозі 100 мг на 1 кг маси ентерально протягом 1 місяця, восьмої серії отримували препарат у вказаній дозі на фоні інтенсивних динамічних навантажень. Тваринам дев'ятої серії вводили препарат сандокал-Д у зазначеній дозі впродовж 1 місяця (табл. 2.1).
Тварини в групах А слугували контролем до тварин І-IV дослідних серій відповідно до термінів експерименту (ІА - 5,5 місяців, ІІА - 6 місяців, ІІІА - 6,5 місяців, IVA - 7,5 місяців).
З експерименту тварин виводили шляхом декапітації під ефірним наркозом, після чого проводили їх скелетування. Забирали на дослідження плечові, стегнові та великогомілкові кістки, їх промивали дистильованою водою, просушували між листками фільтрувального паперу та зважували на аналітичних терезах ВЛР-200 з точністю до 0,1 мг. Остеометрію проводили за методом W. Duerst (1926) з точністю до 0,01 мм та досліджували такі показники: довжину кістки, ширину проксимального епіфізу, ширину дистального епіфізу, передньо-задній розмір середини діафізу, ширину середини діафізу.
Гістологічно вивчали компактну і губчасту речовини, наростковий хрящ проксимального відділу великогомілкової кістки. Брали фрагменти кістки з ділянки епіфізів і середини діафізу, які фіксували в 10 % розчині нейтрального формаліну, декальцинували в 5 % розчині мурашиної кислоти і заливали целулоїдином у блоки. Виготовляли гістологічні зрізи товщиною 10-15 мкм, які забарвлювали гематоксилін-еозином і за ван Гізон.
Таблиця 2.1
Розподіл тварин
№Назва серіїКіл-сть тваринІТварини після оваріектомії, реадаптація 2 тижні (вік 5,5 міс)Група А8Група Б8ІІТварини після оваріектомії, реадаптація 4 тижні (вік 6 міс)Група А8Група Б8ІІІТварини після оваріектомії, реадаптація 6 тижнів (вік 6,5 міс)Група А8Група Б8IVТварини після оваріектомії, реадаптація 10 тижнів (вік 7,5 міс)Група А8Група Б8VТварини з остеопорозом в умовах помірних динамічних навантажень8VIТварини з остеопорозом в умовах інтенсивних динамічних навантажень8VIIТварини з остеопорозом при поєднаному застосуванні помірних динамічних навантажень та сандокал-Д8VIIIТварини з остеопорозом при поєднаному застосуванні інтенсивних динамічних навантажень та сандокал-Д8IXТварини з остеопорозом при застосуванні препарату сандокал-Д8ВСЬОГО104
Морфометричні дослідження діафізу, проксимального і дистального кінців довгих кісток здійснювались за Г.Г. Автанділовим (1980) [3] за допомогою окулярного гвинтового мікрометра (МОГ-1-15). Визначали площі структур і кількісний підрахунок їх елементів. При характеристиці наросткового хряща використовували класифікацію В.Г. Ковешнікова (1980) [40].
Морфометрія наросткового хряща включала наступні показники: ширина хряща, ширина зони проліферуючого хряща, ширина зони дефинітивного хряща, кількість клітин у стовпчиках зони проліферуючого хряща та кількість клітин в стовпчиках зони дефінітивного хряща. Кількість хондроцитів підраховували в стовпчику відповідно до місця вимірювання ширини наросткового хряща.
Морфометричні дослідження діафізу складались з визначення площі поперечного перетину діафізу компактної речовини, площі поперечного перетину кістковомозкового каналу, ширини шару внутрішніх оточуючих пластинок, ширини шару зовнішніх оточуючих пластинок, ширини остеонного шару, діаметру остеонів, діаметру каналу остеонів.
Для трансмісійних ультраструктурних досліджень використовували шматочки проксимального наросткового хряща великогомілкової кістки, які послідовно фіксували у 2,5 % розчині глютаральдегіду, 1 % розчині чотирьохокису осмію, дегідратували у висхідному