Особливості клінічних проявів, перебігу та лікування псоріазу у осіб похилого віку.

РОЗДІЛ 2
Матеріали та методи дослідження.
2.1. Клінічна характеристика хворих.
Клінічному обстеженню підлягали 150 хворих на псоріаз (чоловіків–92, жінок–58)
в віці від 60 до 74 років та 100 хворих молодого та зрілого віку. Дані пацієнти
лікувалися стаціонарно в шкірному відділенні й амбулаторно в Дніпропетровському
міському шкірно-венерологічному диспансері в період з 1996–2001 р.р.
Конторольну групу склали 30 осіб без шкірної патології, похилого віку. Всі
пацієнти до початку лікування підлягали комплексному клініко-лабораторному
обстеженню, анамнестичному аналізу. У 132 похилих хворих на псоріаз
досліджували стан імунної системи і прооксидантно-антиоксидантного балансу.
2.2. Дослідження імунологічних показників.
При вивченні імунного статусу людини одним з важливіших пока­зників, що
характеризують стан імунної системи, є кількісна оцінка субпопуляції
Т-лімфоцитів, та їх індексу імунорегуляції – співвідношення кількості
Т-хелперів та Т-супресорів. Порушення показників Т-системи імунітету та
інверсія індексу імунорегуляції зустрічаються при ряді аутоімунних,
інфекційних, алергічних, пухлинних захворювань, первинних та вторинних
імунодефіцитних станах.
Для ідентифікації різних субпопуляцій Т-лімфоцитів ми використали
лімфоцитотоксичний тест (ЛЦТ) [123]. Для визначення загальної кількості Т- та
В-лімфоцитів, Т-хелперів і Т-супресорів за методом ЛЦТ ми застосовували такі
моноклональні антитіла («Ortho Diagnostics», США):
(CD3+) – реактивність до всіх периферичних Т-лімфоцитів;
(CD4+) – реактивність до Т – хелперів \ індукторних лімфоцитів;
(CD8+) – реактивність до Т - супресорів \ цитотоксичних лімфоцитів;
(CD22+) – реактивність до всіх периферичних В – лімфоцитів.
Лімфоцити виділяли за методом A. Бейум [15], з перифери­чної крові. Джерелом
компліменту в ЛЦТ була кроляча сировотка (пул сироваток від 20—30 кроліків),
котру зберігали у пластикових пробірках при температурі - 70°С та одночасно
разморожували безпосередньо перед використанням. ЛЦТ здійснювали у планшетах
для імунологічених досліджень одно­разового використання. В лунку планшета
вносили 40 мкл суспензії лімфо­цитів в концентрації 2·106 клітин в 1 мл и 5 мкл
моноклональних антитіл в робочому разведе­нні. Інкубірували 5 хв. при 37°С,
додаючи 5 мкл компліменту та витримували 45 хв. при 22 °С. Фарбування проводили
з 50 мкл 0,2 % розчину тріпанового синього у фізіоло­гічному розчині у продовж
5—10 хв. Результати ЛЦТ оцінювали на підставі підрахування у камері Горяєва
відсотку фарбованих лімфоци­тів на 200 клітин.
Для кількісного визначення імуноглобулінів сироватки крові використовували
метод простої радіальної імунодифузіі [79,145].
Дослідження НСТ-тесту (спонтаного) проводилось нами за методикою Г.Н.Драник
[46]. Для оцінки тесту підраховували 100 нейтрофілів і обчислювали процент
позитивних клітин (нейтрофіли, що містять забарвлені у темно-синій колір
гранули формазану). Кінцевий результат виражається як цитохімічний показник
активності (ЦПА). Для цього підраховується 100 клітин, потім множиться
порядковий номер групи на кількість клітин, що її складають. Результати
сумуються і сума поділяється на 100. Одержана величина і становить ЦПА.
Методика виявлення циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) базується на осадженні
їх із сироватки крові за допомогою поліетіленгліколю (молекулярна маса 6000) з
кінцевою концентрацією 3,5%. Результат виражали в одиницях оптичної щільності
[235].
2.3. Визначення концентрації малонового діальдегіду.
Показником інтенсивності ВРО є кінцевий його продукт малоновий діальдегід
(МДА). Визначення концентрації МДА виконували за методом Стальної І.Д.,
Гаришвілі М.С. (1977) [125]. Принцип методу заснований на здатності МДА при
високій температурі реагувати з 2-тіобарбітуровою кислотою, утворюючи
фарбований триметіловий комплекс з максимумом поглинання при довжині хвилі 532
нм.
До 0,1 мл сироватки крові, додавали 1 мл 20% трихлороцетової кислоти (ТХО) та
свіжеприготованої 0,9% тіобарбітурової кислоти (ТБК) (90 мг ТБК розчиняли при
нагріванні в 10 мл дистільованої води). Вміст закривали пробкою та переносили у
киплячу водяну баню на 20 хвилин. В якості контролю застосовували проби, які
містять буферний розчин. Реакцію припиняли охолодженням в холодній воді. Проби
центрифугували 10 хв. при 3000 об\хв. Оптичну щільність вимірювали на
спекрофотометрі “Specol-10” при довжині хвилі 532 нм. Концентрацію МДА виражали
в нмоль\мл.
2.3. Визначення концентрації дієнових кон`югатів.
Принцип методу визначення вмісту ДК [124] полягає в екстрагуванні ДК сумішшю
гептану та ізопропілового спирту і визначенні їх вмісту у гептановій фазі.
До 0,5 мл сироватки крові доливали 9 мл екстрагуючої суміші гептан: -
ізопропіловий спирт в об`ємному співвідношенні 1:1. Розчин гомогенізували на
протязі 5 хвилин в скляному сосуді типу Поттера-Елвегейма з тефлоновим
пестиком. Потім проби переливали в центрофужні пробірки та цетрифугували 10
хвилин при 3000 об\хв. В кожну з них додавали по 1 мл дистильованої води (рН2).
Після двократного струшування та розшарування фаз відбирали гептанову фракцію,
котра находилася зверху. Оптичну щільність виміряли на спектрофотометрі Perkin
Elmelzambda – 20 при 232 нм. Як контроль використовували проби, які містять
тільки екстрагуючу фазу. Вміст дієнових кон`югатів в пробі розраховували
походячи з величини молярного коефіцієнту екстинції при 232 нм для сполученних
дієнів поліненасичених жирних кислот, що дорівнює 2,2·105 см –1 · м –1 .
2.4. Визначення активності супероксиддисмутази.
Активність СОД визначається неферментативним методом [217], який заснований на
здатності СОД інгібірувати