Ви є тут

Особливості мікроклонального розмноження та адаптації садивного матеріалу гібрида тополі сірої ? тополі білої (Populus canescens Sm. х Populus alba L.)

Автор: 
Пінчук Андрій Петрович
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2004
Артикул:
0404U003303
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

2.1. Вибір експланту

На мікроклональне розмноження впливають генотип, вік рослини-донора, сезонність ізоляції, а також розмір первинного експланту.
Бруньки відбирали з гетерозисного гібрида тополі Populus canescens х Populus alba. Із всіх факторів, які визначають успіх мікроклонального розмноження, найбільше значення має генотип вихідної рослини. У межах виду генотипи розмножуються легше інших.
Суттєвий вплив на реалізацію морфогенетичного потенціалу в процесі мікророзмноження спричиняють сортова і видова специфіка вихідного експланту. Відмічено, що види рослин, які добре розмножуються вегетативно, звичайно проявляють високу регенераційну здатність в культурі in vitro. Сортові особливості проявляються і при укоріненні мікропагонів [25, 26].
Ексланти відбирали з 12-річної рослини-донора, в зв'язку з тим, що фізіологічний вік вихідного ексланту впливає на прояв здатності до морфогенезу. Зрілі зародки, 20-30 -денні проростки або різні їх частини (ювенільний матеріал) характеризуються високими морфогенетичними потенціалами у порівнянні з тканинами дорослих рослин і здатні утворювати у великій кількості адвентивні бруньки, стимулювати розвиток пазушних меристем, які в подальшому формують добре ростучі пагони здатні до укорінення [25, 26].
Вік первинного експланту суттєво впливає і на укорінення мікропагонів, які розмножуються in vitro. Із збільшенням віку вихідного експланту, як правило, знижується здатність пагонів до укорінення.
Зважаючи на те, що тканини і органи, ізольовані в момент вегетації рослин, відрізняються більш високою чутливістю до складу поживного середовища і краще утворюють адвентивні бруньки, формують пагони і укорінюються, ніж ті які ізольовані в період глибокого природного і вимушеного спокою. Ізоляцію експлантів проводили у лютому і березні. Відмічено, що тканини, виділені весною, дають найбільший процент регенерованих рослин.
Розмір експланту є одним із факторів, який визначає успіх мікроклонального розмноження. Чим менший експлант, тим гірша його регенераційна здатність. Експланти більшого розміру із значною кількістю диференційних тканин (паренхіми, провідної тканини і камбію) можуть незалежно від співвідношення фітогормонів у поживному середовищі спонтанно утворювати бруньки. З іншого боку, у великому за розміром експланті збільшується можливість появи в його клітинах вірусів та інших патогенів, що ускладнює оздоровлення розмножуваних видів у культурі. Оптимальна величина експланту залежить від видових особливостей рослини-донора і властивостей органу, який служить джерелом вихідного матеріалу.
У проведених дослідженнях експлантом слугували меристемні ділянки розміром 0,1-0,2 см. Вони відзначались активною реалізацією морфогенетичного потенціалу розвитку з наступним утворенням повноцінних рослин.
2.2. Стерилізація посуду, інструментів та вихідного рослинного матеріалу

Стерилізація посуду, матеріалів і інструментів проводять в металічних тубусах сухим жаром у сушильній шафі при температурі 180°C протягом 1год. При цьому вносилася поправка на час, який необхідний для нагрівання завантажених у шафу предметів до заданої температури.
У боксі, безпосередньо перед роботою і в процесі посадки інструменти ще раз стерилізували, поміщаючи у фарфорову склянку з 96%-вим етиловим спиртом з наступним фламбуванням кожного із них у полум'ї спиртівки. Стерильний інструмент використовували тільки для одноразової маніпуляції. Перед повторним використанням інструмент знову стерилізували зануренням в етанол і фламбуванням.
Для усунення джерел можливої інфекції тканевих і клітинних культур (бактерії, спори, гриби) стерилізацію операційної кімнати проводили ультрафіолетовим випромінюванням, яке згубно діє на вегетуючі форми мікроорганізмів. Для цього використовували бактерицидні ультрафіолетові лампи.
Отримання стерильного вихідного матеріалу являє собою складне завдання, оскільки поверхня тканин органів рослин уражена епіфітною мікрофлорою (бактеріями, грибами та їх спорами). Однак внутрішні тканини здорових рослин вважаються стерильними, хоча і в них можуть знаходитись непатогенні бактерії, які не завжди виявляються. Правильний вибір стерилізуючої речовини заключається в тому щоб нейтралізувати епіфітну мікрофлору і не пошкодити тканину рослин. Крім того, речовина не повинна проникати в тканину і легко змиватись.
Для кожного об'єкту режим стерилізації встановлюється експериментально. Однак існують загальні правила, яких слід дотримуватися [6,25, 26, 27].
Для досягнення оптимальних результатів стерилізацію рослинних тканин проводили комбінацією декількох стерильних речовин.
Перед стерилізацією тканину очищали від залишків землі, засохлого листя, покривних лусок. Бруньки і листки ретельно промивали теплою водою з милом, потім деякий час (15 хв) ? промивали проточною і ополіскували дистильованою водою.
Стерилізацію починали із занурення рослинного матеріалу в 70% етанол: листки, бруньки занурювали на 10-30 секунд. Обробка тканин етанолом руйнує восковий наліт на листках, підсилює дію стерилізуючих речовин. Етиловий спирт (C2H5OH) використовували для попередньої стерилізації об'єктів посадки і покращення дії інших стерилізуючих речовин. При цьому скорочується час проведення стерилізації і підвищується її ефективність.
Для стерилізації інтактних рослин використовували великий набір різних стерилізуючих речовин: гіпохлорит натрію, препарати срібла і ртуті.
Гіпохлорит натрію (NaНClO) використовували у вигляді 0,5-5 % розчинів протягом 20-30 хв. Гіпохлорит натрію є клітинною отрутою і після його використання багаторазово промивали експланти в стерильній дистильованій воді.
Для стерилізації пагонів, листків, насіння використовували 0,05 % розчин мертіолят натрію при експозиції 10-15 хв. Не дивлячись на його токсичність для тканин, цей розчин при правильному підборі концентрації і режиму стерилізації дає задовільні результ