ГЛАВА 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Объект исследования.
В работе использовали половозрелых крыс-самцов линии Вистар массой 200-250 г. Объектом исследования были кровь, сердце, легкие и сосуды животных. Животные были разделены на группы в зависимости от задач эксперимента.
1. Интактные животные (контроль).
2. Животные, которым подкожно вводили CdCl2?2,5Н2О (0,28% раствор в 0,9% NaCl) в дозе 1,4 мг на 100 г массы тела ?230?. Крыс брали в опыт через 0,5, 2, 6 и 24 ч после инъекции.
3. Животные, которым внутрибрюшинно вводили фенилгидразин (1,4% раствор в 0,9% NaCl) в дозе 7 мг на 100 г массы тела ?231?. Крыс брали в опыт через 0,5, 2, 6 и 24 ч после инъекции.
4. Животные, которым внутрибрюшинно вводили унитиол (5% раствор) в дозе 25 мг на 100 г массы тела. Крыс брали в опыт через 1, 2,5, 6,5 и 24 ч после инъекции.
5. Животные, которым за 30 мин до введения хлорида кадмия вводили унитиол (в вышеуказанных дозах). Крыс брали в опыт через 0,5, 2, 6 и 24 ч после инъекции соли металла.
6. Животные, которым за 30 мин до введения фенилгидразина вводили унитиол (в вышеуказанных дозах). Крыс брали в опыт через 0,5, 2, 6 и 24 ч после инъекции фенилгидразина.
Все животные перед забоем голодали 12 ч без ограничения в питьевой воде. Эксперименты на животных осуществляли в соответствии с правилами "Европейской конвенции защиты позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях". Забой проводили путем декапитации в первой половине суток под легким эфирным наркозом. Во время наркоза у животных брали из хвостовой вены кровь для определения содержания гемоглобина в крови крыс.
После декапитации кровь собирали в сухие пробирки для получения сыворотки и отдельно в стаканчик со стабилизатором для получения эритроцитов. Для получения сыворотки пробирки помещали на холод. Через 2 ч сыворотку отделяли центрифугированием в течение 20 мин при 3 тыс. об/мин. В качестве стабилизатора для получения эритроцитов использовали 4% раствор цитрата натрия. Эритроциты трижды отмывали в физиологическом растворе, приготовленном на 0,01 М трис-НСl буфере (рН=7,4).
Исследуемые органы перфузировали in situ холодным физиологическим раствором через сердце. Навеску сердца и легких измельчали, продавливали через пресс, а затем гомогенизировали с 0,1 М К,Nа-фосфатным буфером на холоду в гомогенизаторе с тефлоновым пестиком 60 секунд (скорость вращения - 1000 об/мин, зазор стекло-тефлон - 0,2 мм). Навеску сосудов (Aorta, A. hepatica, A. vertebralis, V. cava superior) измельчали в жидком азоте, затем гомогенизировали 60 сек (скорость вращения - 1000 об/мин, зазор стекло-тефлон - 0,2 мм) и 60 сек (скорость вращения - 1000 об/мин, зазор стекло-тефлон - 0,1 мм).
2.2. Методы исследования
2.2.1. Определение содержания гемоглобина в крови
Содержание гемоглобина в крови определяли с помощью тест-набора производства "Lachema" (Чехия). Принцип метода основан на определении стабильного гемиглобинцианида, образующегося в результате взаимодействия гемоглобина с феррицианидом и цианидом калия.
Состав набора:
- реактив 1 - N-метил-D-глюкаминовый буфер (2,22 ммоль), цианид калия (1,54 ммоль), феррицианид калия (1,09 ммоль);
- реактив 2 - эталонный раствор гемоглобина, содержащий цианид калия (0,077 ммоль) и феррицианид калия (0,61 ммоль), в фосфатном буфере (1,03 ммоль).
Для определения Hb в пробирку с 5 мл реактива 1 добавляли 0,02 мл крови, взятой из хвостовой вены, и немедленно перемешивали. Через 10 мин стояния измеряли оптическую плотность пробы против реактива 1 при 540 нм на спектрофотометре СФ-26. Расчет проводили по калибровочной кривой, построенной с использованием эталонного раствора гемоглобина с различными концентрациями, учитывая разведение крови. Содержание гемоглобина в крови выражали в г Hb на 1 л крови.
2.2.2. Определение содержания общего гема в сыворотке, а также в гомогенатах сердца, легких и сосудов
Метод основан на том, что в смеси пиридина и щелочи гем дает характерный диффернциальный спектр, переходя в форму пиридингемохромогена. Для этого 0,2 мл сыворотки или 0,05 мл гомогената сердца и легких или 0,1 мл гомогената сосудов смешивали с равным объемом 1% раствора дезоксихолата, через 10-15 мин к пробе добавляли 3 мл смеси (0,15 М NaOH и 25% пиридин). Полученную смесь разливали в 2 кюветы, добавляя в одну несколько кристаллов дитионита, а в другую - несколько кристаллов феррицианида калия. Дифференциальный спекр записывали на двулучевом регистрирующем спектрофотометре Specord UV VIS, измеряли разность экстинций при 557 и 575 нм ?232?.
2.2.3. Определение содержания ТБК-активных продуктов в сыворотке, а также гомогенатах сердца, легких и сосудов
Принцип метода основан на определении интенсивности окраски, образующейся в ходе реакции между МДА и тиобарбитуровой кислотой (ТБК), протекающей в кислой среде и при высокой температуре. Образующийся в результате триметиновый комплекс, содержащий одну молекулу МДА и две молекулы ТБК, имеет характерный спектр поглощения с максимумом при 535 нм.
Для определения уровня МДА к 0,2 мл сыворотки или 0,5 мл гомогената легих, сердца и сосудов добавляли 3 мл 1,4% раствора ортоосфорной кислоты и 1 мл 0,8% раствора ТБК. Пробы перемешивали и выдерживали на бане при температуре 100 ?С в течение 45 мин. Затем смесь охлаждали и экстрагировали окрашенный продукт 3 мл бутанола. Разделение водной и органической фаз достигали центрифугированием при 3000 об/ мин в течение 10 мин. Затем измеряли оптическую плотность бутанольных экстрактов при ?=535 нм против бутанольного экстракта контрольной пробы, которую готовят аналогично опытным пробам, используя вместо 0,2 мл сыворотки или 0,5 мл гомогената соответствующий объем дистиллированной воды. Содержание ТБК-активных продуктов рассчитывали, используя коэффициент экстинции 1,56?105 М-1см-1, и выражали в нмоль МДА/ 1 л сыворотки или нмоль МДА/ 1 мг белка для гомогенатов ?233?.
2.2.4. Определение содержания восстановленного глутатиона в эритроцитах и гомогенатах серд
- Київ+380960830922