РАЗДЕЛ 2
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнялась в отделе биотехнологии Никитского ботанического сада - Национального научного центра (НБС-ННЦ) УААН в 1992-2000 годах. В процессе исследований использовали районированные и перспективные сорта вишни (Cerasus vulgaris Mill): Эрди Ботермо, Подбельская, Чернокорка, Коросска и сорта сливы (Prunus domestika L.): Стенлей, Гвардейская Синяя, Персиковая, Венгерка Юбилейная. Эти сорта, представляют интерес для практической селекции и имеют большое значение для внедрения и широкого распространения в промышленном садоводстве.
Обследование по выявлению вирусов вишни и сливы проводили в промышленных посадках Симферопольского, Бахчисарайского, Джанкойского и Нижнегорского районов, а также в коллекционно-селекционных и маточно-черенковых насаждениях Степного и Центрального отделений НБС-ННЦ. Оценку поражённости растений проводили методом визуальной диагностики, используя общепринятую терминологию описания симптомов поражения (Смит, 1960; Мэтьюз, 1973; Гиббс, Харрисон, 1976). Для проведения дальнейших исследований отбирали образцы вишни и сливы с признаками вирусных заболеваний, таких как: мозаичность, некротизация, хлороз, деформация листовых пластинок, задержка в развитии побегов и симптомы поражения генеративных органов. Обследования, как правило, выполнялись весной (апрель-май) и продолжались до периода воздействия высоких температур. В этот период у значительной части больных деревьев проявлялись отчётливые симптомы вирусных болезней. Для подтверждения вирусной этиологии болезней идентифицировали возбудителей. С этой целью применяли метод биотестирования на травянистых и древесных индикаторах (Кеглер и др., 1986). В качестве травянистых индикаторов использовали Chenopodium quinoa Willd, Ch. amaranticolor cost et Reyn, Ch. murale L., Ch. foetidum Schrad, Cucumis sativus L. сорта "Delikatess", Nicotiana tabacum L., N. clevelandii Gray, Phaseolus vulgaris L. var. Saxa, Tetragonia eхpansa из семейств маревых, паслёновых и тыквенных.
Отбор лепестков и молодых листьев для тестирования сортов на заражённость вирусами с помощью метода травянистых тест-растений осуществляли в период апрель-май.
Растения инфицировали методом механической инокуляции на стадии 4-8 настоящих листьев, Cucumis sativus заражали в стадии семядолей. Механический перенос из листьев, а также лепестков вишни и сливы проводили с использованием экстрактивной стабилизирующей среды: 0,015 М раствор диэтилдитиокарбоната натрия, содержащей 0,03 М кофеина, разведённый в фосфатном буфере Соренсена (рН=8). Соотношение тестируемого материала и экстрактивной среды составляло 1:3.
Индексацию осуществляли натиранием листьев для каждого испытуемого образца не менее шести травянистых индикаторов, у Cucumis sativus (не менее 10 растений), через 7-18 дней учитывали реакцию индикаторов. В большинстве случаев делали повторные пассажи на Chenopodium quinoa, что позволило определить низкие концентрации вирусов.
Для выявления вирусов хлоротической пятнистости листьев, бороздчатости древесины, мозаики резухи, скручивания листьев вишни и черешни, некроза табака, черной кольцевой пятнистости томатов и кольцевой пятнистости малины использовали индикатор Chenopodium quinoa. Для выявления вирусов некротической и хлоротической кольцевых пятнистостей косточковых плодовых культур использовали индикатор Cucumis sativus ("Delikatess"). Для выявления вируса шарки слив использовали Ch. foetidum. Для определения вируса скручивания листьев черешни (вишни) использовали Ch. amaranticolor и Ch. murale.
Анализы проводили с марта по май месяц в тепличных условиях согласно методике проведения опыта. Использование метода травянистых растений-индикаторов позволяет определить лишь сокопереносимые вирусы. Кроме того, реакция на травянистых растениях-индикаторах не всегда является специфичной. Поэтому следующим этапом дополнительно применяли древесные растения-индикаторы, выращиваемые в специально созданном питомнике.
Набор древесных растений-индикаторов состоял из следующих видов и сортов: Cerasus serrulata Lendl. (Schirofugen), Persica vulgaris Mill. (Elberta, JF-305), C. tomentosa (Thunb.) Wall., C. avium (L.) Moench. (Bing, Sam), Prunus domestica L. (Italian prune), Malus platycarpa Rehd (таксономия по Mosyakin, Fedoronchuk ) (табл. 2.1).
Таблица 2.1
Индикаторы, используемые для диагностики вирусов косточковых
плодовых культур
ИндикаторВирусное заболеваниеCerasus serrulata
(Schirofugen)Некротическая кольцевая пятнистость, иволистность, скручивание листев сливы, отмирание сливы, хлоротическая кольцевая пятнистость, желтуха вишни.Persica vulgaris
(Elberta, GF-305)Некротическая кольцевая пятнистость, хлоротическая кольцевая пятнистость, ленточный узор, ямчатость древесины косточковых, Х-болезнь, иволистность, карликовость, розеточность.C. tomentosaШарка, иволистность, некротическая кольцевая пятнистость, ямчатость древесины.Malus platycarpaНекроз плодов, линейная мозаика.C. avium (Bing)Скручивание листьев черешни и вишни, рашпилевидность листьев.C. avium (Sam)Mелкоплодность.Prunus domestica
(Italian prune)Шарка, иволистность, линейная мозаика
Отбор черенков в саду для диагностики и тестирования на древесных растениях-индикаторах проводили в июле - начале августа.
Тестирование и ретестирование оздоровлённого материала вишни и сливы проводили с помощью иммуноферментного анализа (ELISA-метод) по сендвич - варианту [62, 198] на приборах системы SUMAL PE-2 фирмы Carl Zeiss Jena с использованием сывороток из ГДР и МНИИП "Кодру" к следующим вирусам: PNRSV, PDV, PPV, ACLSV, ArMV, CLRV, RRV и TomRSV. Каждый образец тестировали в двух повторностях. Положительными считались образцы, для которых значение оптической плотности ферментной реакции превышало более чем в 2 раза значение оптической плотности негативного контроля и среднего значения оптической плотности субстратных (контрольных) лунок. Для поиска безвирусных деревьев каждого сорта во время обследовани