РАЗДЕЛ 2
Материал и методы исследования
2.1. Материал исследования
Материалом для данного исследования послужили эмбрионы, плоды и сердца детей до дефинитивного возраста (7-ми лет) в количестве 120 объектов. Эмбриональный и плодный материал нами был получен из абортария городской больницы №7 города Днепропетровска после медицинских абортов от практически здоровых женщин. Сердца поздних плодов и детей были получены в областном патологоанатомическом бюро и областном судебно-медицинском морге города Днепропетровска. Распределение материала по возрастным группам проведено согласно Л.К.Семеновой и Л.И. Фалину (таблица 2.1) [160, 161].
Таблица 2.1
Распределение материала исследований по возрасту
ПериодВозрастКоличество объектов Пренатальный Зародышевый5-8 недель 11 Плодный9-12 недель 10 13-16 недель 9 17-20 недель 11 21-24 недель 8 25-28 недель 10 29-32 недель 10 33-36 недель 9 37-40 недель 11 ПостнатальныйДо 1 года 10 1-3 года 11 4-7 лет 10 Всего 120 2.2. Методы исследования
2.2.1. Макро-микроскопические методы.
Препарирование использовалось для выделения сердец эмбрионов на ранних стадиях развития и плодов человека при изучении синтопии сердца и выделении сердца из грудной полости. Препарирование предварительно фиксированных эмбрионов проводилось под бинокулярной лупой по общепринятой методике. Топографические срезы эмбрионов получали из парафиновых блоков, в которые был залит предварительно фиксированный материал.
Сердца взрослых людей препарировались для выделения фрагментов 14-ти региональных зон, для последующей фиксации, проводки и получения гистологических срезов.
2.2.2. Гистологические методы
Для изучения структурных компонентов стенки сердца и их взаимоотношений использовали гистологические и полутонкие срезы, окрашенные стандартными гистологическими методиками.
Для гистологического исследования ткани сердца кусочки миокарда фиксировали в жидкости Буэна; после обезвоживания заключали в парафин. На санном микротоме МС-2 изготовляли срезы ткани толщиной 7 мкм. Для приготовления обзорных препаратов проводили окрашивание гистологических срезов с использованием гематоксилина-эозина и железного гематоксилина Гейденгайна. Для этого срезы после депарафинизации предварительно обрабатывали 2,5 % раствором железо-аммиачных квасцов в течение 6 мин при температуре + 70?С и окрашивали раствором Гейденгайна (0,5 г гематоксилина в 10 мл этанола и 90 мл дистиллированной воды) в течение 4 мин при температуре + 80?С. После обезвоживания окрашенные срезы заключали в бальзам. На ранних стадиях пренатального развития (4-8 недель) использовали окраску по Маллори-Слинченко, для выявления соединительной ткани, а именно элементов коллагеновых и эластичных волокон сердца, а на более поздних окраску по Ван Гизону.
Для изучения тонких структур (эндокардиальной выстилки, эпителиально-мезенхимных превращений, кардиогеля, появления первых соединительнотканных волокон) готовили полутонкие срезы толщиной 1-2 мкм (эпон-аралдит; ловикрил) и использовали для стереологического анализа. Для изготовления полутонких срезов фрагментов сердца кусочки ткани объемом около 1 мм3 фиксировали в 2,5 % растворе глютаральдегида, изготовленном на 0,1 М фосфатном буфере (pH 7,4) на протяжении 2-х часов при комнатной температуре. Дофиксацию проводили 1% раствором четырехокиси осмия на том же буфере на протяжении 2-х часов. После обезвоживания кусочки ткани заключали в смесь эпона и аралдита в соответствии с рекомендациями [118, 162]. Полутонкие срезы толщиной 1 мкм приготовляли на ультрамикротоме УМТП-5-М. Для приготовления обзорных препаратов проводили окрашивание полутонких срезов метиленовым синим - азуром II- основным фуксином. Для этого на полутонкие срезы наносили 1 мл красящего раствора (рН 6,9), содержащего 0,13 % метиленового синего, 0,02 % азура II, 10 % глицерина, 10 % метанола при + 65?С в течение 5-6 мин. После тщательной промывки срезы помещали на 1 мин в 0,05 % раствор основного фуксина при комнатной температуре. После промывания и высушивания на срезы наносили иммерсионное масло и накрывали покровным стеклом.
В настоящее время иммуно-гистохимические методы исследования получили широкое распространение в изучении гистогенетических процессов кардиогенеза, в связи с их высокой чувствительностью и информативностью. Данный метод позволяет количественно оценивать процессы клеточного роста, как в норме, так и при патологии. Для изучения процессов васкулогенеза был использован цитоспецифичный маркер CD-34, который накапливается и окрашивает в коричневый цвет сосудистый эндотелий. Внутренним контролем данного метода окрашивания является накопления маркера CD-34 в эндокарде развивающегося сердца. Из тканеспецифичных маркеров был выбран нами виментин. Виментин представляет собой филаментный протеин, присутствующий в тканях мезенхимального происхождения. Пролиферативную активность изучали при помощи иммуноклональных антител Кi-67, которые идентифицируют ядерный антиген, присутствующий в большинстве размножающихся клеток. Для оценки процессов программированной клеточной гибели (апоптоза) нами использовался онкосупрессор P-53 в различных региональных участках сердечной стенки в эмбриональном периоде.
2.2.3. Морфометрия, статистический анализ
В рамках морфологии системное исследование характеризуется двумя основными требованиями: количественным описанием свойств структурно-функциональных элементов объекта и определением связи между ними [163-164]. При этом первую часть системного исследования выполняют с помощью методов количественной морфологии. При проведении морфологического исследования сердца руководствовались общими принципами стереометрического анализа, выложенными в работах [118, 163-164]. Морфометрические исследования проводились на уровне целого органа, участка органа, гистологического среза и поля зрения м
- Київ+380960830922