Ви є тут

Клінічне значення інтерлейкінів та імунної відповіді при сальмонельозі у дітей.

Автор: 
Басок Оксана Степанівна
Тип роботи: 
Дис. канд. наук
Рік: 
2006
Артикул:
0406U003818
129 грн
Додати в кошик

Вміст

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дисертаційну роботу виконано протягом 2000-2005 рр. на клінічній базі кафедри
дитячих інфекційних хвороб Харківського державного медичного університету
(ХДМУ) (завідувач кафедри – д.мед.н., професор С.В. Кузнєцов) в обласній
дитячій інфекційній клінічній лікарні (ОДІКЛ) м. Харкова (головний лікар – Л.Я.
Манжела). Лабораторні дослідження проводились у лабораторії кафедри; клінічній,
бактеріологічній, вірусологічній, біохімічній лабораторіях ОДІКЛ та
імунологічній лабораторії Регіонального дитячого центру клінічної імунології
обласної дитячої клінічної лікарні №1 м. Харкова.
Обстежено 169 дітей у віці одного місяця - трьох років, з них 139 – хворих на
кишкову форму сальмонельозу та 30 практично здорових дітей, які склали
контрольну групу.
Сальмонельоз реєструвався у дітей першого року в 1,5 рази частіше, ніж другого
і 1,9 рази – третього року життя, дещо частіше у дівчаток.
Обстеження хворих передбачало аналіз скарг, епідеміологічний анамнез й анамнез
життя, оцінювання даних об’єктивного огляду в динаміці захворювання та
результатів додаткових лабораторно-інструментальних досліджень (клінічні
аналізи крові та сечі, копрологічний, бактеріологічний, серологічний,
біохімічний методи дослідження, ультразвукове сканування органів черевної
порожнини). В основу верифікації діагнозу покладено такі ознаки: етіологія,
тяжкість, клінічна форма та перебіг хвороби. Формулювання діагнозу з
урахуванням вищезазначених ознак не протеречить класифікаціям, що
застосовуються лікарями України та Росії [3, 230].
Для діагностики супутньої патології застосовували комплекс клініко-лабораторних
та інструментальних методів, набір яких змінювали адекватно до конкретного
випадку. При необхідності запрошували консультантів з інших медичних
спеціальностей.
Поряд із загальноприйнятими лабораторними методами, проводили імунологічні
дослідження: визначення кількісного вмісту про- та протизапальних інтерлейкінів
крові, популяцій та субпопуляцій імунних клітин, імуноглобулінів основних
класів. Дослідження проводили в динаміці патологічного процесу: до початку
лікування хворих (у гострому періоді) та після закінчення його (в періоді
ранньої реконвалесценції). За необхідності – частіше.
Визначення рівнів інтерлейкінів крові проводили твердофазним імуноферментним
методом [231, 232] із застосуванням стандартних наборів реагентів ProCon ІL-1b,
ProCon ІL-2, ProCon ІL-4, ProCon ІL-6, ProCon ІL-8 виробництва „Протеиновый
контур” (Санкт-Петербург, Россия).
Периферійну кров у кількості 1 мл., що була взята у хворого натще з ліктьової
вени, після згортання центрифугували при швидкості 3000 об/хв. і виділяли
сироватку, яку застосовували для дослідження. Як індикаторний фермент
використовували пероксидазу хрону, в якості твердої фази – планшети з
сорбованими на їх внутрішній поверхні антитілами до інтерлейкінів. Сироватку
вносили до лунки планшету й інкубували на протязі 2 годин при температурі
+37°С, для зв’язування антигену з антитілами. Після інкубацій і промивок
дистильованою водою до лунок вносили кон’югат пероксидази зі стрептавидином,
знову інкубували на протязі години при температурі +37°С, промивали, вносили
субстрат і вимірювали активність зв’язаної пероксидази за допомогою
автоматичного спектрофотометру довжиною хвилі 450 нм. Чим більше мічених
ферментом вторинних антитіл зв’язалось з комплексами антиген-антитіло, тим вищі
активність ферменту й інтенсивність забарвлення розчину. Розрахунки
концентрації інтерлейкінів проводили за допомогою каліброваної кривої „оптична
щільність / концентрація”.
Дослідження популяцій і субпопуляцій імунних клітин проводили методом непрямої
імунофлюоресценції [231, 232, 233] з використанням моноклональних антитіл до
поверхневих антигенів лімфоцитів CD виробництва ВАТ „Сорбент” (Москва, Росія).
Проводили визначення CD3+ – Т-лімфоцитів, CD4+ – Т-хелперів, CD8+ –
цитотоксичних лімфоцитів, CD14+ – моноцитів та макрофагів, CD16+ – натуральних
кілерів (NK-клітин), CD19+ – В-лімфоцитів. У методиці антитіла мітили
флюорохромом, який флюоресцував під дією світла довжиною хвилі 488 нм.
Для проведення цього дослідження периферійну кров у кількості 1 мл., взяту
натще з ліктьової вени, збирали з додаванням гепарину (5 од/мл). Зразки з
фібриновим згустком або інтенсивним гемолізом не використовували. Лімфоцити
виділяли на градієнті щільності Фікол-Верографіну (1,077 г/мл). Потім додавали
мічені флюорохромом моноклональні антитіла, інкубували при температурі +37°С на
протязі 30 хвилин, готували мазки та досліджували їх за допомогою
флюоресцентного мікроскопу Люмам Р-8 (виробництва Ленінградського
оптико-механічного об’єднання «ЛОМО») з використанням об'єктиву 90х і окуляру
7х, застосуванням набору фільтрів, конденсорів, що замикають світлофільтри.
Мікроскопію робили в затемненому приміщенні. Результати реакції враховували
впродовж 24 годин після її виконання. Позитивним результатом вважали клітини,
що світились по периферії. Результати дослідження подавали у вигляді відносної
кількості лімфоцитів різних популяцій.
Виміри рівнів імуноглобулінів основних класів проводили методом простої
радіальної імунодифузії у гелі (G. Mancini et al., 1965) [231, 232] із
застосуванням моноспецифічних сироваток проти сироваткових IgM, IgG, IgA людини
виробництва «МЕДГАМАЛ» ДУ НДІЕМ імені ак. Н.Ф. Гамалеї (м. Москва). Виконання
та сутність методу полягає в наступному: в агарі, який містить антитіла,
вирізали лунки, в які вносили сироватку крові. В результаті антигени сироватки
дифундирували з лунок у агар і