РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Об'єкт і матеріал досліджень
Експериментальна частина роботи виконана впродовж 2000-2005 років на кафедрі екології та біології Львівського державного аграрного університету в межах науково-дослідної тематики кафедри: "Розробити системи моніторингу природного середовища в умовах сільськогосподарського виробництва", № держреєстрації 0100U002334. Окремі дослідження виконані в Академії Подляскій (м.Сєдлце, Польща).
Дослідження проводились на 120 безпородних білих щурах масою 180-200 г, яких утримували за умов віварію. Проведено 3 варіанти дослідів:
І. Вивчення впливу кадмію на еритропоез і метаболізм в еритроцитах щурів за одноразового парентерального введення CdCl2 (10 мг/кг). Тварин використовували в дослідах через 1, 3 і 10 діб після введення CdCl2;
ІІ. Дослідження метаболічних ефектів кадмію в еритроцитах тварин, тренованих до гіпоксії: щурам вводили CdCl2 на 5-у добу після щодобового піднімання на висоту 3500 м (рО2 = 91 Торр, впродовж трьох годин) і використовували в експериментах через 1 і 3 доби після введення CdCl2;
ІII. Дослідження корекції селеном метаболічних ефектів кадмію в еритроцитах щурів: Na2SeO3 (0,1 мг селену/1 кг маси) вводили через 1 год після ін'єкції CdCl2 і використовували в дослідженнях через 1, 3 і 10 діб.
Хлорид кадмію вводили тваринам шляхом одноразової внутрішньочеревної ін'єкції у дозі 10 мг/кг маси тварин. При виборі дози користувались даними літератури [18, 107, 176, 221, 256]. Детальні умови досліджень приведені в таблиці 2.1.
Таблиця 2.1.
Групи тварин і умови досліджень
Групи тваринКількість
тваринУмови досліджень1Контрольна15Інтактні тварини2Контрольна35Щурі, яким вводили 0,85% NaCl3Дослідна524 год після введення CdCl2 (10 мг/кг)4Дослідна53 доби після введення CdCl2 (10 мг/кг)5Дослідна510 діб після введення CdCl2 (10 мг/кг)6Дослідна5Дія гострої гіпоксії (щури перебували в барокамері - висота 9000 м, рО2 = 32 Торр, 3 год.)7Дослідна51 доба після початку тренування до гіпоксії: тварини перебували в барокамері на висоті 3500 м (рО2 = 91 Торр), впродовж 3 год.8Дослідна53 доби після початку тренування до гіпоксії: тварини щодоби перебували в барокамері на висоті 3500 м (рО2 = 91 Торр), впродовж 3 год.9Дослідна55 діб після початку тренування до гіпоксії: тварини щодоби перебували в барокамері на висоті 3500 м (рО2 = 91 Торр), впродовж 3 год.10Дослідна510 діб після початку тренування до гіпоксії: тварини щодоби перебували в барокамері на висоті 3500 м (рО2 = 91 Торр), впродовж 3 год.11Дослідна55 діб після 10-добового тренування до гіпоксії,
(рО2 = 91 Торр).12Дослідна51 доба після введення CdCl2 щурам, тренованим до гіпоксії (токсикант вводили щурам на 5-у добу після початку тренування до гіпоксії, рО2 = 91 Торр)13Дослідна53 доби після введення CdCl2 щурам, тренованим до гіпоксії (токсикант вводили щурам на 5-у добу після початку тренування до гіпоксії, рО2 = 91 Торр)14Дослідна51 доба після введення CdCl2 (10 мг/кг) і Na2SeO3 (0,1 мг селену/1 кг маси тварин). Селеніт натрію вводили через 1 год. після ін'єкції CdCl2 15Дослідна53 доби після введення CdCl2 (10 мг/кг) і Na2SeO3 (0,1 мг селену/1 кг маси тварин). Селеніт натрію вводили через 1 год після ін'єкції CdCl216Дослідна510 діб після введення CdCl2 (10 мг/кг) і Na2SeO3 (0,1 мг селену/1 кг маси тварин). Селеніт натрію вводили через 1 год. після ін'єкції CdCl2 Тваринам контрольних груп вводили фізіологічний розчин в такому ж самому об'ємі.
Умови гіпоксії створювали підніманням щурів у барокамері на умовну висоту 3500 м н.р.м. (рО2 = 91 Торр) впродовж 3 год. щодоби. Умови гострої гіпоксії створювали витримуванням щурів у барокамері на умовній висоті 9000 м н.р.м. (рО2 = 32 Торр) впродовж трьох годин. Як контроль слугували інтактні тварини.
Матеріалом досліджень була змішана периферійна кров, яку отримували шляхом декапітації щурів дослідних і контрольної груп, і органи (печінка, нирка, селезінка, серце, скелетний м'яз, легені), отримані у тварин дослідних і контрольних груп після декапітації і обезкровлення. Декапітацію здійснювали під легким ефірним наркозом, дотримуючись "Правил проведення робіт з використанням експериментальних тварин".
2.2. Визначення кількості еритроцитів і гематокриту крові
Дослідження кількісного вмісту еритроцитів здійснювали шляхом підрахунку в камері Горяєва за допомогою загальноприйнятої методики [28, 32]. Гематокрит крові визначали за допомогою мікроцентрифуги МЦГ-8.
2.3. Фракціонування еритроцитів крові
Відносний вміст еритроцитів різного віку (молоді, зрілі і старі клітини) визначали після фракціонування суспензій еритроцитів у градієнті густини сахарози згідно з методом [47]. Метод базується на змінах густини в залежності від віку еритроцитів [103]. Основною рушійною силою фракціонування є піднімальна сила, що розподіляє еритроцити знизу вверх уздовж вертикальної осі колонки.
У процесі аналізу еритроцити суспендували в 0,85% NaCl (в об'ємному співвідношенні 1:9) і вносили в cкляну колонку (розміром 10 х 200 мм) в об'ємі 0,5 мл. Колонку залишали на 10 хв для створення природної гравітаційної диференціації клітин, після чого встановлювали під кутом 60?. На суспензію клітин нашаровували по 2 мл 30%, 26%, 22%, 18%, 14%, 10% і 6% розчинів сахарози, після чого колонку закріплювали у вертикальному положенні. Отримували 7 фракцій клітин, розподілених в градієнті густини сахарози в порядку зменшення їх плавучої густини. Фракції еритроцитів збирали в окремі пробірки і за допомогою спектрофотометричного методу визначали їхній відносний вміст. На основі цитологічного аналізу дві верхні фракції, збагачені ретикулоцитами, об'єднували в популяцію молодих клітин, в середніх фракціях містились зрілі, а в нижніх - старі в функціональному відношенні еритроцити.
2.4. Визначення кислотної резистентності еритроцитів
Стійкість еритроцитів до гемолізу