РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Характеристика експериментальних моделей
2.1.1. Культури клітин. В експериментах було використано прикріплені та суспензійні лінії клітин людини та тварин: А431 (епідермоїдна карцинома вульви людини), M-HeLa (карцинома шийки матки людини), КВ (епідермоїдна карцинома слизової оболонки порожнини рота людини), COLO320HSR (аденокарцинома товстої кишки людини), Mewo (злоякісна меланома людини), MCF-7 (фіброцистома молочної залози людини), U251 (гліобластома людини), CESS (В-клітини людини, трансформовані EBV), Molt-4 (Т-клітинний гострий лімфобластний лейкоз людини), Raji (лімфома Беркітта людини), Namalwa (лімфома Беркітта людини), Jurkat (Т-клітинна лімфома людини), СЕМ (Т-клітинний гострий лімфобластний лейкоз), клітинні сублінії А431/1522 і M-HeLa/1522, що отримано на основі ліній клітин А431 і M-HeLa в результаті їх трансфекції кДНК трансформуючого фактора росту типу ?. Лінії клітин було отримано з Інституту молекулярної біології ім. В.А. Енгельгардта АН Росії та Інституту цитології АН Росії, за винятком лінії клітин CESS, що була люб'язно надана професором E.A. Clark (Університет штату Вашингтон, Сіетл, США).
2.1.2. Штами мікроорганізмів та вірусів. Для визначення антимікробної активності препаратів використовували культури бактерій (Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus mesentericus ATCC 31029, Staphylococcus aureus P-209, Staphylococcus aureus ATCC 52923, Micrococcus luteus ATCC 10240, Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Escherichia coli K12 (l), Escherichia coli ATCC 25922, Proteus vulgaris ATCC 13315) і грибів (Fusarium graminearum, Penicillium griseus, Mucor plumbum, Candida albicans), отримані з Української колекції мікроорганізмів Інституту мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України. Реципієнтний штам Escherichia coli HB101, трансформований рекомбінантною плазмідою 1522 [70], був люб'язно наданий професором D. Salomon (Лабораторія біології та імунології раку, Національний Інститут раку, Бетезда, США). Штам аденовірусу Adh5 був люб'язно наданий чл.-кор. НАН України Н.С. Дяченко (Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України).
2.1.3. Пухлини людини. В дослідженнях використано клінічний матеріал нормального та злоякісно трансформованого епітелія вульви та шийки матки який було отримано з відділення онкогінекології Інституту онкології АМН України (зав. відділом проф. Л.І.Воробьова). За клінічними та гістологічними ознаками пухлини були верифіковані як плоскоклітинний рак 1-ої, 2-ої та 3-ої стадій.
2.1.4. Методи культивування клітин. Всі клітини вирощували у середовищах DMEM або RPMI 1640 з додаванням 10% сироватки ембріонів великої рогатої худоби (ЕТС) (Gibco BRL, Великобританія) у насиченій вологою атмосфері 5% СО2. Для культивування використовувались скляні чашки Петрі (Anumbra, Німеччина), пластикові матраци, чашки і планшети (Nunc, Данія; Costar, США).
Експресію кДНК ТФР-? в сублініях клітин А431/1522 і M-HeLa/1522 по досягненні конфлюентного моношару індукували шляхом зміни середовища на таке, що не містить фенолового червого з 1,5 - 3 мкМ CdCl2 , після чого клітини інкубували протягом 48 год без сироватки. Середовище після інкубації клітин (кондиційоване середовище) збирали для використання в подальших експериментах.
2.2. Біохімічні методи дослідження
Для виділення та очищення білків та пептидів (ЕФР, ТФР-?, дефенсинів) в роботі було застосовано стандартні методи препаративної біохімії, переважно хроматографічні, низькошвидкісне та високошвидкісне цетрифугування; для дослідження отриманих препаратів використовували метод електрофорезу в градієнті поліакріламідного гелю, Вестерн-блот аналіз та радіоізотопні методи.
2.2.1. Кислотно-етанольна екстракція білків. Кислотно-етанольну екстракцію білків проводили за слідуючим методом [222]. Тканини гомогенізували в рідкому азоті. До гомогенату додавали кислотно-етанольну суміш (375 мл етанолу; 7,5 мл концентрованої соляної кислоти; 10 мл води; 25 мг ФМСФ) з розрахунку 6 мл на 1 г тканини. Через 12 год екстракції при 4оС гомогенат центрифугували при 50 000 g 30 хв. Супернатант відбирали, доводили в ньому pH до 3,5 5%-им розчином гідроокису аммонія та заливали охолодженою сумішшю етанолу та ефіру (1:2) з розрахунку 6 мл суміші на 1 мл супернатанту. Після 24 год екстракції при -20оС білки осаджували центрифугуванням 20 хв при 3 000g, а осад перерозчиняли в 0,2 М оцтовій кислоті з розрахунку 0,5 мл на 1 г вихідної тканини.
2.2.2. Виділення ЕФР з тканин. ЕФР отримували з підщелепних слинних залоз безпорідних мишей-самців вагою 25-30 г розводки віварію ІЕПОР НАНУ. При отриманні високоочищенного епідермального фактора росту брали до уваги методичні підходи, опубліковані раніше [223, 224]. За 10 діб до видалення слинних залоз мишам одноразово вводили в черевну порожнину пропіонат тестостерону в дозі 10 мкг на одну тварину. Підщелепні залози видаляли під ефірним наркозом, подрібнювали в рідкому азоті та проводили кислотно-етанольну екстракцію. На першому етапі очищення екстракт білків збагачували на міні-колонці Sep-Pak C18. Розчинені в 0,2 М оцтовій кислоті зразки порційно наносили на промиту та врівноважену 0,2 М оцтовою кислотою колонку, потім промивали 10 % розчином ацетонітрилу та елюювали зв'язану фракцію 60 % ацетонітрилу. Елюат ліофілізували, перерозчиняли в 0,2 %-у розчині трифтороцтової кислоти (ТФО) та наносили на напівпрепаративну колонку Bondapak C18 (Waters, США). Очищення велося в лінійному градієнті ацетонітрилу (0-60%). Фракції, що відповідали ЕФР, збирали та ліофілізували. Концентрацію ЕФР визначали на спектрофотометрі Beckman DU 8B (Швеція), виходячи з формули (Е215 - Е225) х 155 = мкг/мл.
2.2.3. Очищення ТФР-? з кондиційованого середовища. Очищення ТФР-? проводили шляхом хроматографії на міні-колонці Sep-Pak C18 згідно з методом [225]. На колонку, що була попередньо відмита 5 мл метанолу та врівноважена 10 мл 5% ацетонітрилу з 0,045% ТФО, наносили 5 мл кондиційованого
- Київ+380960830922