Оглавление
2
Оглавление
Оглавление...........................................................2
Список сокращений,...................................................5
1. Введение,.........................................................8
2,Обзор литературы..................................................13
2.1. Классическая чума свиней и средства профилактики 13
2.2.Технология выращивания вирусов..............................32
2.3.Инактиванты и их характеристики.............................37
2.4.Адъюванты и их свойства.....................................42
2.5.3аключение по обзору литердт^рад«....».....;.;..............47
3. Собственн ые исследован ия.......................................49
3.1 .Материалы и методы.........................................49
3.1.1,Материал ы...........................................49
3.1.1.1.Вирус ы........................................49
3.1.1.2.Культуры клеток................................49
3.1.1.3.Среды и растворы...............................49
3.1.1.4.Реактив ы......................................50
3.1.1.5.Животны е......................................50
ЗЛЛ.б.Оборудование.....................................50
3.1.2,Метод ы..............................................57
3.1.2.1.Выращивание культур клеток.....................51
3.1.2.2.0бработка сыворотки крупного рогатого
скота ПЭГ..............................................51
З.1.2.З.Выращивание вируса КЧС в культу ре клеток 51
3.1.2.4.0пределение инфекционной активности вируса.52
3.1.2.5.Концентрирование вируса........................52
3.1.2.6.Инактивация вируса КЧС.........................53
3.1.2.7.0пределение полноты инактивации вируса 53
3.1.2.8.Выделение РНК..................................54
3.1.2.9.Синтез кДНК....................................54
3.1.2.10.Постановка ПЦР................................54
Оглавление 3
3.1.2.11.Рестрикционный анализ...........................55
3.1.2.12.Приготовление инактивированной вакцины.... 55
3.1.2.13.0ценка иммуногенности вакцины...................55
3.1.2.14.Статистическая обработка результатов исследований.............................................55
3.2.Результаты собственных исследований...........................57
3.2.1.Усовершенствование технологии получения вирусного сырья.........................................57
3.2.1.1.Выбор клеточной системы и штамма
вируса КЧС...............................................57
3.2.1.2.Условия выращивания вируса.......................58
3.2.1.2.1 .Время культивирования....................59
3.2.1.2.2.Сыворотка крови различных видов животных............................................59
3.2.1.2.3.Метод культивирования.....................62
3.2.1.3.Генетическая стабильность штамма вируса......64
3.2.2.Усовершенствование технологии изготовления инактивированной вакцины................................68
3.2.2.1.Концентрирование вируса..........................68
3.2.2.2.Условия хранения вирусного сырья.................70
3.2.2.3.Кинетика инактивации вируса......................72
3.2.2.4.Выбор адъюванта..................................76
3.2.2.5. Условия хранения вакцины........................81
3.2.3.Усовершенствование методов иммунобиологического контроля вакцины.......................................82.
3.2.3.Юценка полноты инактивации вируса..................82
3.2.3.1.1 .Биологическим методом...................82.
3.2.3.1.2.Методом ПЦР..............................83.
З.2.З.2. Оценка иммуногенности вакцины..................89.
3.2.3.2.1.Изучение иммуногенности вакцины на свиньях 89
3.2.3.2.2.0ценка иммуногенности вакцины на кроликах.................................................91
к
Обзор литературы
14
Возбудитель Вирусную природу чумы установили в 1908 г. Е.А. De Schweinitz и М. Dorset. Вирус КЧС относится к семейству Flaviridae род Pes-tivirus. Вирионы сферической или овальной формы размером 40-45 нм; нук-леокапсид 25-35 нм, покрытый суперкапсидной оболочкой толщиной ~ 64 нм. Коэффициент седиментации 108±24,5 S, плавучая плотность 1,16-1,20 г/см3. Нуклеокапсид состоит из одного белка с молекулярной массой 14 кД. Двуслойная липидная оболочка содержит 3 гликопротеина: Е0 (44/48 кД), Ej (33 кД) и Е2 (55кД). Моноклональные антитела к гликопротеинам Е0 и Е2 обладают вируснейтрализующей активностью (66, 73, 92, 104, 131).
Вирусный геном представляет собой однонитчатую плюс-РНК, состоящую из 12284 нуклеотидов с единственной длинной открытой рамкой считывания, соответствующей полипротеину длиной в 3898 аминокислотных остатков. Молекулярная масса вирусной РНК 4X10 Д, коэффициент седиментации 40-45 S в градиенте сахарозы (39, 106, 142, 131).
Антигенная структура Выделенные в Европе штаммы однородны по антигенной структуре. По вирулентности различают А-, В- и С-варианты вируса. В группу А входят вирулентные эпизоотические штаммы, вызывающие у свиней всех возрастов остро протекающую болезнь, а также лапинизирован-ные и холодные варианты культурального вируса. Вирусы серогруппы В вирулентны только для поросят и при циркуляции в стаде, вызывают так называемую атипичную или хроническую чуму. К группе С относится американский слабовирулентный штамм 331. Все штаммы ВКЧС серологически близкородственны, что указывает на их антигенную однородность (39, 62, 73).
Культивирование Культивирование вируса в лабораторных условиях на неиммунных свиньях можно проводить практически бесконечно. Вирус удается также репродуцировать в гомологичных (свиных) и гетерологичных культурах клеток без цитопатического действия. В настоящее время в лабораториях для культивирования и титрования вируса в основном применяют перевиваемую культуру клеток почки поросенка РК-15. (28, 73, 74)
Обзор литературы
15
Устойчивость Вирус КЧС малоустойчив к высоким температурам. Полная инактивация вируса при температуре 37°С наступает через 18-20 суток, при 56°С через 60 минут, при кипячении - моментально. Низкие температуры его консервируют. В свиных тушах он остается вирулентным после 2-6-месячного хранения в холодильнике при температуре минус 25°С. Хорошо сохраняется в лиофилизированном состоянии, стабилен при pH 5-10. Быстро инактивируется хлороформом, эфиром, дезоксихолатом, чувствителен к трипсину и липазам (28, 39, 73, 131).
Симультантные прививки
Экспериментальные исследования, проведенные в начале XX столетия (E.A.De Schweinitz , M.Dorset в 1903; M.Dorset и соавт. в 1905; F. Hyutyra в 1906. R.Ostertag в 1907; V.Wassermann в 1908; P.Uhlenhuth в 1908,1912 гг.) доказали наличие стойкого пожизненного иммунитета у свиней, переболевших чумой. Это послужило первоначальным толчком к поиску специфических средств защиты животных от этой болезни (4, 52, 115). В скором времени были получены высокоактивные гипериммунные сыворотки путем введения переболевшим свиньям возрастающих доз вирулентного вируса (105), что послужило основной предпосылкой к проведению исследований по си-мультантным прививкам (путем одновременного введения гипсриммунной сыворотки и эпизоотического вируса КЧС).
Первые исследования в этом направлении были проведены М. Dorset в 1905 - 1906 г.г., в ходе которых была доказана возможность формирования напряженного иммунитета против КЧС после симультантных прививок (121). В дальнейшем этот метод нашел широкое применение в США и во всем мире. В нашей стране применение симультантных прививок было начато в 1926 г. Н.П. Урановым. В 1931г. они были разрешены Главным управлением ветеринарии для применения в широкой практике (69).
M.Dorset, Р. Ulenhuth, R. Ostertag, W. Wassermann, а у нас в стране П.Н. Андреев разработали схемы гипериммунизации свиней и технологию про-
- Київ+380960830922