• " £Ф$Щі 'Щ;-'*) {іЩйір '&Ж.Щрф}№
'*№&*$*<” -K.
, :#■?»). .л •*--■- jp {'.f$ ; ?•> Ї wäj. (• ■• V \ ■ *’•' ?>■**«j/s»’?' £У-<*j?.'
моделі£x?^Viiy Л-.^.v u • '. •' ..
'** *"-.’ - ,,.~ ......,.,;.rv..4 ,vi-/. , •iV.-y.; Iî8®«S® ’
'ÏHp'fï
WZiy-']
ЛГ/М.
:<уда«іЦСї>і4 •' !ЙС^?)?^>«)«1У9.РДц' і*Х^>/л?ьХС«.*
•: і: '>•: l]R(êfë?f
[(:. :;•/: f«§*.Vf?C?.ЦС^ХЙФ^ C?viX*-‘^'^Adi?/*>ÿjES ЇЦ^$ТЯ(ІЖ^>і
' -Я))ф?Фг?й* ,УлФХ^.?Ш®
$ШОД*ДО
?/■' Ре? - 3/ - g
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
1.1. Актуальность проблемы. В комплексе мероприятий по предупреждению и ликвидации вирусных болезней птиц ведущая роль отведена вакцинации. Успехи вакцинопрофи-лактики наиболее распространенных заболеваний общеизвестны. Однако в ряде случаев вакцинные препараты не удовлетворяют практических специалистов по эффективности, способам применения, остаточной реактогенности и ряду других показателей. Характерна в этом отношении ситуация, сложившаяся в области специфической профилактики ньюкаслской болезни (НБ). Несмотря на наличие большого разнообразия живых и инактивированных вакцин, строгих ограничительных мер по предупреждению заноса и распространения инфекционного начала, многие птицехозяйства страны по-прежнему находятся под постоянной угрозой возникновения НБ. Существует предположение, что при попадании патогенного вируса в крупные птицеводческие хозяйства с многолетним непрерывным технологическим процессом выращивания он может длительное время циркулировать среди вакцинированных цыплят, вызывая атипичную или бессимптомную формы болезни (Alexander D. J., 1997 и др.). В таких ситуациях протективные возможности традиционных вакцин из лентогенных штаммов оказываются исчерпанными. Как правило, самые напряженные и жестко детерминированные схемы иммунопрофилактики с помощью препаратов из штаммов “Ла-Сота”, “В1”, “Бор-74 ВГНКИ”, кардинального успеха не приносят, поскольку не препятствуют репликации вирулентного вируса и его распространению в стаде (Calnek B.W., 1997 и др.). Использование же производимой в РФ вакцины из мезогенного штамма МН’\ хорошо зарекомендовавшей себя в условиях эпизоотической нестабильности и неблагополучия, ограничено ее остаточной вирулентностью для цыплят младших возрастных групп и строго индивидуальным способом применения путем внутримышечной инъекции
Не исключена также гипотетическая вероятность антигенной модификации современных вирулентных штаммов НБ, в результате чего профилактические препараты, предложенные 40-50 лет тому назад, оказались не в состоянии блокировать их эпизоотический потенциал.
Исходя из изложенного, разработка вакцины против НБ из нового мезогенного штамма, антигенно родственного эпизоотическим вирусам, предназначенной для крупногруппового применения, в неблагополучных и угрожаемых по псевдочуме пунктах представлялась актуальной и соответствовала запросам практических ветеринарных специалистов.
В последнее время многие страны с развитой индустрией птицеводства вынуждены были приступить к массовой профилактике ранее неизвестных или не имеющих эпизоотического значения заболеваний, какими являются инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) и синдром снижения яйценоскости (ССЯ-76) (Ecky Н. et al, 1976, М. С. Ferran J.B., 1978).
В РФ против ИББ в 1991 году была предложена вакцина из штамма “ВНИВИГГ, •7г:---'пая, сьнрав на определенном этапе свою положительную роль, оказалась неэффектив-& ' чагах с клиническим проявлением ИББ и не всегда предотвращала вспышки болезни
хйГгствах угрожаемой зоны (Алиев А.С.,1992,1998). Поэтому разработка вакцины из * заемых “промежуточных” и “горячих” штаммов представлялась весьма своевре-
* также послужила одной из задач наших исследований.
• эофилакгики ССЯ-76 в стране до последнего времени также существовала единственная о э \-Ьженная ВНИВИП н МГП «Вирион» (Рождественский И.К., Хохлачев О.Ф., 1993). ^ с w ****** было сосредоточено на малом предприятии, имеющем ограниченные тех-
' охцности, и ни в коей мере не удовлетворяло потребностей птицеводства. Кроме 'уут>; сп» вакцины не позволяла многим хозяйствам начать плановую иммунопро ' то и явилось основанием для создания альтернативной технологии получения
;'>у-7Щ : = | //.ступной вакцины, не уступающей известным аналогам в эффективности.
нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей использовали пакет прикладных программ SeqProgs (Data handling for inolecular epidemiology) версия 1.0 (N.J.Knowles, IFAN, Великобритания), с применением алгоритмов филогенетического пакета Phylip 3.5с (Felsenstein 11 PHYLIP, Version 3.5с/ Department of Genetics, University of Washington, Seattle,!993). Исследования проводили совместно с сотрудниками ВНИИЗЖ Дрыгиным В.В., Грибановым О.Г., Щербаковой Л.О.)
Морфологию вакцинных и эпизоотических штаммов изучали совместно с Могильным Ю.А. при помощи электронного микроскопа JEM- 100x11 методом негативного контрастирования вируссодержащих образцов 4% фосфорно-вольфрамовой кислотой, нанесенных на сетку с формваруглеродной пленкой-подложкой при инструментальной увеличении х 40000- 112000.
Результаты опытов обрабатывали статистически методом Стьюдента с учетом рекомендаций Лакина Р.Ф. (1980).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. НЬЮКАСЛСКАЯ ВОЛЕЗНЬ*
По данным Международного эпизоотического бюро в 1998 году в мире было зарегистрировано 2385 неблагополучных по НБ пункта. Причем, на некоторых континентах вновь начала прослеживаться тенденция их увеличения. Так, в Европе после крупной эпизоотии НБ в 1993-94 гг. (390 неблагополучных пунктов только в Германии) в 1996 году было зафиксировано 69 случаев возникновения ньюкаслской болезни, а в 1997 году - уже 79.
В РФ в 1996 - 1998 гг. было установлено всего лишь 10 пунктов, где заболевание проявлялось клинически. Однако, заметно увеличилось количество хозяйств, где НБ протекала на привитом поголовье без каких-либо симптомов и характеризовалась только появлением чрезвычайно высоких титров специфических антител, снижением сохранности и продуктивности По мнению ряда ученых, одной из причин, объясняющих данную ситуацию, может быть изменение антигенной или конформационной структуры полевых вирусов НБ, что неизбежно при длительном направленном антительном прессинге (Collins H.R.,1994)
Следствием этого является неполная комплементарностъ измененного вируса антителам, формирующимся в ответ на введение большинства традиционных вакцин, предложенных более 40 лет назад и до настоящего времени производящихся отечественной биологической промышленностью.
Поэтому одной из задач данного раздела являлась разработка нового профилактического препарата из вакцинного штамма НБ максимально “поздней'’ селекции. Такой штамм, обозначенный “ГАМ-61” (“А(в)ВН”), был получен Мкхальским Г.А. в начале 70-х годов путем аттенуации вирулентного вируса НБ перемежающимися пассажами на первичной культуре клеток почки теленка и куриных эмбрионах. При этом, основные биологические свойства штамма были не известны.
Предстояло изучить некоторые генетические параметры штамма “ГАМ-6Г\ оценить его иммунобиологические свойства, разработать технологию промышленного изготовления вакцины на основе данного штамма и испытать ее антигенную активность и иммуно-генностъ в лабораторных и полевых условиях, подготовить НД.
3.1.1. Идентификация штамма *‘ГАМ-61". Положительные результаты задержки ге-магглютинации шт. “ГАМ-61 ” только моноспецифнческими сыворотками к вирусу ньюкаслской болезни свидетельствовали о принадлежности его к роду парамиксовирусов (ПМВ) 1-го серотипа. Степень антигенного родства шт. “ГАМ-61” с вирусами "Ла-Сота”, “Бор-74 ВГНКИ”, “В Г, “Н” и “Т-53”, рассчитанная по формуле Арчетги и Хорсфалла, составила 90- 100 %, что доказывало, практически, полную их тождественность. Результаты
*- данный раздел работы выполнен совместно с Руденко Т.В., Горе вой И.П., Родиным Ю.В.
7
перекрестной PH данных вирусов также позволили отнести шт.ТАМ-61” к первому серо-тшгу ПВМ, поскольку IN во всех случаях был выше 8,0 - 8,5 lg ЭИД^ (ЭЛД^).
Вследствие недостаточной чувствительности используемых серологических реакций, обнаружить какие-либо антигенные различия между штаммами в данных опытах не удалось. Поэтому была предпринята попытка определения нуклеотидной последовательность участков генов HN и F, кодирующего сайт разрезания белка FO в обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) в сравнении с другими вакцинными и эпизоотическими штаммами вируса НБ для выявлений изменений в структуре, кодируемых данными генами пептидов.
Основные характеристики штамма ИГАМ-6Г\
3.1.2 Морфология. При электронномикроскопическом исследовании вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости шт. “ГАМ-61” был представлен типичными для пара-миксовирусов вирионами округлой, филламентознон формы размером 80-120 нм с пепло-мерами по всей поверхности мембраны. Матрикс вириона средней электронной плотности, зернистой структуры. Контаминация чужеродными вирусами не установлена
3.1.3. Устойчивость штамма к химическим и физическим факторам. По устойчивости к действию физико-химических факторов штамм не отличался от известных характеристик других представителей семейства иарамиксовирусов первого серотипа.
После обработки эфиром и хлороформом в течение 18 ч при температуре 4вС инфекционный титр соответственно снижался на 3,75-5,0 lg ЭЛД^ и 2,25-6,6 lg ЭЛД^ (признак Eth’H Ch ). Четырехчасовое воздействие кислой и щелочной среды (pH 3,0; 10,0) существенной потери инфекционной и ГА-активности не вызывало (0,5-1,0 lg ЭЛД^ и 1,0-2,0 Iog2 соответственно). Прогревание вируссодержащей ЭЭЖ при 56°С не приводило к полной инактивации инфекционной и гемагглютинирующей активности вируса даже через 60 мин. Однако, при 37°С инфекционная активность сохранялась в течении 7 сут, хотя потери достигали 2,0-3,0 lg ЭЛД^ Хранение вируса при 4*С не приводило к полной инактивации даже в течение 4 лет (срок наблюдения), что позволило сделать заключение о его терморезистентно сти (признак Ts+).
Используемый в опытах контрольный шт. “Т-53” при данных режимах полностью инактивировался, тогда как вакцинный шт. “Н” имел сопоставимые со шт. “ГАМ-61” показателя. Полученные результаты согласовывалось с данными литературы о более высокой термостабильности вакцинных штаммов в сравнении с вирулентными (Alexander D.J., 1997, Сюрин В.Н., 1998).
3.1.4. Гемагглютинируюшая и нейпаминидазная активности. Штамм “ГАМ-61” показал широкий спектр гемагглютинирующей активности, вступая во взаимодействие с эритроцитами кур, голубей, уток, гусей, кроликов, морских свинок, барана, крупного рогатого скота, при этом ГА-титр достоверно не отличался.
Нейраминидазная активность шт. ТАМ-6Г для субстрата 4-метил-умбеллиферил-Д-ней-минида (4-МУФ-НК) имела значение 150Q+50 мкг/мл/ч, что было выше на 100-120 ед , чем у шт. “Н” и ниже на 400 и 1628 ед , чем у шт. “JIa-Сота” и “Бор-74 ВГНКИ”. Полученные данные согласовывались с известной закономерностью об обратной зависимости между нейраминидазной активностью и вирулентностью штаммов НБ (Креймер Ю.Х., 1986).
3.1.5. Способность к venvobvmmu в различных биологических системах. Способность штамма к репродукции в эмбрионах кур (ret**-признак) оценивали при различных температурно-временных режимах инкубирования и заражающих дозах ( 0,1-7,0 ^ЭЛД,^.
Было установлено, что шт. “ГАМ-6 Г'наиболее активно размножался при температуре 37+Р,5°С, при этом инфекционный титр достигал значения 8,5-9,5 ^ЭЛД^, гемагглютини-рующий - 8,0 !ogr При пониженной температуре (25ннО,5*С) и повышенной (40+р,5вС) размножение вируса замедлялось и выход его был на 2,7-3,3 lg ниже.
Накопление вируса в ЭЭЖ* эмбрионов кур также зависело от инфицирующей дозы и времени инкубирования. Установлено, что наибольший выход вируса был при заражении эмбрионов в дозе 5,0 lg ЭЛД50 и времени инкубирования 48-72 ч, что нашло отражение в
8
- Київ+380960830922