Тест-системы на основе полимерных микросфер для лабораторной диагностики инфекционного бронхита кур

2
ОГЛАВЛЕНИЕ
Стр.
ВВЕДЕНИЕ....................................................... 6
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Таксономия вируса ИБК..................................... 10
1.2. Характеристика вируса ИБК............................... 11
1.2.1. Морфология и химический состав........................ 11
1.2.2. Устойчивость к физико-химическим воздействиям......... 13
1.2.3. Антигенная структура.................................. 14
1.2.4. Антигенная вариабельность............................... 16
1.3. Особенности иммунитета при ИБК............................ 22
1.4. Лабораторные методы диагностики ИБК....................... 26
1.4.1. Реакция гемаггл юти нации с трипсинизированным вирусом 27
1.4.2. Реакция непрямой гемаггл ют и наци и.................... 28
1.4.3. Реакция связывания комплемента.......................... 28
1.4.4. Реакция диффузной преципитации.......................... 28
1.4.5. Реакция иммунофлуоресценции............................. 29
1.4.6. Иммуноферментный анализ................................. 30
1.4.7. Полимеразная цепная реакция........................... 30
1.5. Использование полимерных микросфер в диагностике инфекционных заболеваний............................................... 31
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы исследования
2.1.1. Антигены.............................................. 35
2.1.2. Сыворотки............................................... 36
2.1.3. Полимерные суспензии.................................... 36
3
2.1.4. Буферные растворы и реагенты.............................. 37
2.1.5. Оборудование............................................... 38
2.2. Методы исследования
2.2.1. Метод очистки и концентрирования вируса ИБК................ 39
2.2.2. Метод выделения иммуноглобулина с использованием
ПЭГ-4000.................................................... 41
2.2.3. Определение белка........................................ 41
2.2.4. Иммунохимическая характеристика препаратов............... 41
2.2.5. Оценка качества полимерных суспензий..................... 41
2.2.6. Получение антительных латексных диагностикумов и контрольного латекса..........................;................... 42
2.2.7.Метод сенсибилизации ПМ иммуноглобулиновой фракцией сыворотки крови кур................................................. 43
2.2.8. Определение концентрации 1£, адсорбированного на поверхности полимерных микросфср.......................................... 43
2.2.9. Метод сенсибилизации ГГМ, модифицированных протеином А,
антителами сыворотки крови кур..........:.................. 44
2.2.10. Постановка и учет результатов РАЛ........................ 45
2.2.11. Постановка и учет результатов ИФА........................ 47
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Оценка качества полимерных суспензий при создании иммуно-диагностических гест-систсм.............................. 48
3.2. Разработка технологии получения латексной тест-системы на основе антигенов вируса ИБК...................................... 52
3.3. Испытание эксперимент&тьных серий латексных диагностику-
мов на основе антигенов вируса ИБК.......................... 58
Рис. 1.1. Ультраструктура внриона инфекционною бронхита кур
Поверхность вируса ИБК покрыта большими, похожими на гвозди Б-б елкам и. Бульбовидная часть белка называется БІ. Два других белка М и Е лишь немного выдаются за предели поверхности. Внутри частицы находится генетический материал РНК. окруженный четвертом белком N [61].
Высказывается мнение о том, что РНК вируса представлена двумя неравными фрагментами: первый составляет большую часть молекулы (74,9-85.4%), его молекулярная масса 5.105 Дальтон (Д), молекулярная масса второю-0,5- 3,0.106 Д.
13
Оболочка вириона содержит липиды. В вирионе выявлены 4 главных и, по крайней мере, 10 минорных полипептидов. Молекулярная масса главных полипептидов: 52 . 45 , 34 и 32 килодальтод, из которых первый и последний гл и кол и з и рован ы. Считают, что вирус ИБК содержит 16 полипептидов, из которых 4 относятся к глнкопептидам. Кроме того, вирионы содержат РНК-полимеразу. Нейраминидаза у них не обнаружена [23].
Характерные биохимические и биофизические свойства коронавирусов были исследованы 8>с1с1е11 БХЗ. и соавт. [128] и БШппап Ь.Б. и соавт. [136].
1.2.2. Устойчивость к физико-химическим воздействиям.
В трупах павшей птицы вирус быстро теряет инфекционную активность. В питьевой воде при комнатной температуре сохраняется 11 часов; в аллантоисной жидкости при температуре 37°С - в течение 3 дней, при 20-30сС - 24 дня, при 4°С - 427 дней. В инфицированной аллантоисной жидкости при температуре минус 30°С вирус остается активным 17 лет [23]. В пораженных тканях, помещенных в 50% раствор глицерина, вирус при температуре 4°С сохраняет активность до 80 дней, что позволяет доставлять пробы патологического материала в лаборатории без заморозки.
Мод действием ультрафиолетового облучения вирус разрушается через 18-24 часа. Солнечные лучи инактивируют его при 36-38°С за 3 часа. Вирус ИБК более устойчив в кислой среде, чем в щелочной. Скорость снижения титра вируса при помещении его в кислую среду (рН= 3) отличается у разных штаммов [55]. В клеточной культуре вирус ИБК был более стабилен при значениях pH =6,0 - 6,5, чем при pH =7,0 - 8,0 [30].
Вирус ИБК чувствителен к действию большинства дезинфицирующих веществ. Однопроцентные растворы фенола, крезола, формалина, 70% этанола обезвреживают вирус за 3 минуты [11, 23, 24]. При обработке 50% хлороформом (комнатная температура, 10 минут) и 0,1% дезоксихолатом натрия (4°С. 18 часов) все штаммы вируса полностью теряют инфекционность [119].