ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ ВНИИЗЖ - Всероссийской научно-исследовательский институт защиты животных; 1ШИЯИ - Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт;
ВНА - вируснейтрализующие антитела;
ВНК - перевиваемая клеточная культура почки хомячка;
ВБ — вирус бешенства;
ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения;
ГОА - гидроокись алюминия;
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;
ИД50 - 50%-ная инфекци-онная доза;
ИМД50 - 50%-ная иммунизирующая доза;
1BRS - перевиваемая клеточная культура;
ИФА - иммуноферментный анализ;
КРС - крупный рогатый скот;
МАТ - моноклональные антитела;
МЛД- мышиная летальная доза;
МП - микроноситель;
MPC - мелкий рогатый скот;
МФА - метод флюоресцирующих антител;
МЭБ - Международное эпизоотическое бюро;
ЛД50 - 50%-ная летальная доза;
Ig-логарифм при основании 10; log2 - логарифм при основании 2;
СПЭВ - перевиваемая клеточная культура почки эмбриона свиньи;
РСК - реакция связывания комплемента;
ПЦР - полимеразная цепная реакция;
ПАК - полиакриловая кислота;
PII - реакция нейтрализации;
РПИФ-реакция прямой иммунофлюоресценции;
ТФ ИФА-твердофазный иммуноферментный анализ;
ТЦ Дя - 50%-ная тканевая цитопатическая доза;
ЦПД- цитопа тическое действие.
J.I - индекс иммумогенности вакцины
3
СОДЕРЖАНИЕ
стр.
1. ВВЕДЕНИЕ .................................................. 5
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ........................................... 10
2.1. Вирус бешенства и его свойства ............................. 10
2.2. Эпизоотологические особенности бешенства ................... 13
2.3. Культивирование вируса бешенства ........................... 17
2.4. Очистка и концентрирование вируса бешенства ................ 33
2.5. Инактивация вируса и инактиванты ........................... 34
2.6. Адъюванты и их использование в антирабических вакцинах 37
2.7. Определение качества вакцин против бешенства ............... 38
2.8. Заключение по обзору литературы............................. 47
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ . 48
Материалы.................................................... 48
3.1. Вирусный материал .......................................... 48
3.2. Культура клеток ............................................ 48
3.3. Животные ................................................... 48
3.4. Питательные среды .......................................... 48
3.5. Оборудование ............................................... 49
Методы ...................................................... 49
3.6. Культивирование клеток ..................................... 49
3.7. Культивирование вируса бешенства в монослое культуры клеток
ВНК-21 ...................................................... 50
3.8. Культивирование вируса бешенства в суспензии культуры клеток
ВНК-21 ...................................................... 50
3.9. Освежение штамма и подготовка посевного материала .......... 50
3.10. Определение титра инфекционности вируса .................... 51
3.11. Оценка иммуногенной активности инактивированных вакцин .. 51
3.12. Определение титра вируснейтрализующих антител в сыворотке
крови ....................................................... 53
3.13. Определение стерильности вируссодержащей суспензии, антигена
и вакцины ................................................... 53
3.14. Определение безвредности вакцины ........................... 53
3.15. Статистическая обработка результатов исследований .......... 54
12
Нуклеопротеин (N-иротеин) состоит из трех белков, образующих вместе с РНК спиралевидный нуклеокапсид. N-протеин является основным внутренним белком вируса.
Во время морфогенеза вируса N-протеин тесно связан с вириониой РНК, защищая ее от действия рибонуклеаз, при этом он связывается как с позитивной, так и с негативной геномной РНК, формируя позитивный и негативный РНП. В зрелом вирионе N- протеин является главным компонентом внутреннего спирального нуклеокапсида и выполняет функции инкапсидации и защиты генома, кроме этого он вовлечен в процесс регулирования транскрипции и репликации.
Аминокислотная последовательность N-протеина вируса бешенства была выведена от первичной нуклеотидной последовательности штаммов PV, CVS, ERA и SAD-B19 (217, 231). Последовательность N-протеина каждого из этих штаммов состоит из 450 аминокислот и отмечается их высокое родство (98% -99,6%), которое находится в определенном соотношении с их антигенным сходством, при анализе с использованием моноклональных антител (МАТ) (231). Одно исключение представляет N- протеин штамма Flary HEP, который не реагирует с 10 из 37 анти-N моноклональными антителами (231). Иследова-ния шести лиссавирусов, включая Lagos bat, Duvenhage, European bat type 1 и type 2 ( EBL 1 и EBL 2), показали полное аминокислотное сходство последовательностей N-протеина. Фосфолированный участок на N-протеина помечен се-риновым остатком в позиции 389. N-протеин представляет главную мишень для Т-хелиер клеток.
Фосфопротенн (NS или Р протеин). Фосфопротеин состоит из 297 аминокислот и обладает высокой степенью гомологии между штаммами (92%-98%) (150). Фосфопротеин представлен в 2 формах Mi и М2, отличающихся различной степенью фосфорилирования, которое сильно увеличивает общий заряд белка за счет высокого содержания аспарагиновой и глутаминовой аминокислот. Предполагается, что фосфопротеин нуклеокапсида играет роль инициации процесса транскрипции и репликации РНК.
13
Матричный протеин (М протеин). К нуклеокапсиду прилегает мембраноподобный слой толщиной 2,5-3,0 нм, представляющий собой нефосфорили-рованный матричный белок М. Он содержит 202 аминокислоты. Сравнение аминокислотной последовательности М- протеина штаммов вируса бешенства показало 91%-94% гомологии. М- протеин также содержит ковалентно связанную пальмитиновую кислоту. Антигенная структура М- протеина не исследована. Было сделано предположение, что, главная функция матричного протеина находится во взаимодействии с цитоплазматическим доменом гликопротеида и рибонуклеопротеином во время вирусной сборки.
РНК-зависимая РНК -полимераза (L протеин). L-протеин -наибольший протеин рабдовирусов и состоит у вируса бешенства из 2142 аминокислот. В его функции входит синтез, кепирование, метилирование и поли-аденилирование.
2.2. Энизоотологические особенности бешенства
Классические вирусы бешенства в настоящее время широко распространены в мире, за исключением некоторых островных государств (Новая Зеландия, Англия, Япония) и континентов Австралии и Антарктиды. Нет этого заболевания и в ряде государств на севере (Норвегия, Швеция) и юге Европы (Испания, Португалия) (29, 72, 73, 181-185).
Вирус бешенства (генотип 1) поддерживается в природе межвидовой передачей практически повсеместно среди представителей Carnivora (дикие и домашние собаки, представители лисьих, куньих) и Microchiroptera (насекомоядные и кровососущие летучие мыши). В отличие от вируса бешенства, вирусы подобные ему имеют намного более ограниченное распространение (Африка п Европа). Круг поражаемых ими видов до конца не известен и, по-видимому, ограничен мелкими млекопитающими (грызуны, насекомоядные и плотоядные летучие мыши). Человек в этой цепи является лишь временным хозяином вируса (128).
Бешенство в Европе. За последнее столетие в Европе ситуация по бешенству значительно изменилась. После второй мировой войны произошла
- Київ+380960830922