2
ОГЛАВЛЕНИЕ
Стр.
ВВЕДЕНИЕ......................................................... 4
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ....................................... 7
1.1. Краткие сведения об инфекционном ринотрахеите . . 7
1.2. Диагностика инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота ............................................. 10
1.3. Новые методические подходы в лабораторной диагностике инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота..................................................... 16
1.3.1. Использование иммуноферментного анализа для выявления локализации антигенов (гистохимический вариант)............................................. 17
1.3.2. Иммуноферментный анализ с использованием твердой фазы.................................................. 23
1.3.3. Методы твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЫБА )................................................ 24
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ....................................... 34-
ГЛАВА П. ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОПЕРОКСИДАЗНЫХ КОНЪЮГАТОВ И ОТРАБОТКА ПОСТАНОВКИ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ... 34
ПЛ. Литературная справка .................................... 34
П.1.1. Ферменты и субстраты, используемые в иммуно-
ферментном анализе ................................ 34
П.1.2. Методы получения ишунопероксидазных конъюгатов ...................................................... 35
П.2. Материалы и методы...................................... 37
П.З. Результаты исследований ..... ...................... 41
П.3.1. Получение специфической сыворотки. Выделение
гамма-глобулинов .................................. 41
3
П.3.2. Очистка пероксидазы и получение ишлунопе-
роксидазных конъюгатов........................... 45
П.3.3. Сравнительное изучение различных субстратов для пероксидазы..................................... 49
П.3.4. Определение активности, специфичности, чувствительности полученных конъюгатов, отработка БЫ Б а -теста для выявления вируса
ИРТ.............................................. 52
ГЛАВА Ш. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО
АНАЛИЗА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ИРТ И АНТИТЕЛ К НЕМУ 57
111.1. Литературная справка.................................... 57
111.2. Материалы и методы...................................... 59
111.3. Результаты исследований................................. 61
Ш.3.1. Выявление вируса ИРТ иммуноферментным методом при использовании в качестве твердой
фазы культуры клеток............................. 61
Ш.3.2. Использование ЕЫЗА-теста для обнаружения вируса ИРТ в материале от экспериментально-зараженных животных и в полевом материале 62 Ш.3.3. Использование метода еыба для определения антител к вирусу ИРТ крупного рогатого скота.................................................... 69
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ............................... 75
ВЫВОДЫ........................................................... .8?
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ........................................... 88
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................. 89
ПРИЛОЖЕНИЕ.'...................................................... юз
ч
10
экссудатом (34). Лимфоузлы отечны» гиперемированы, увеличены, на разрезе сочны с кровоизлиянием. Слизистая оболочка желудка, толстого и тонкого отделов кишечника несколько отечна и гиперемиро-вана. В других органах и тканях никаких видимых изменений обычно не находят. В препаратах клеточных культур, зараженных вирусом инфекционного ринотрахеита и окрашенных гемотоксилин-эози-вом встречаются внутриядерные включения (47).
Как видно, многообразие клинических форм проявления ИРТ и сходство его течения с другими болезнями вирусной природы (аденоинфекцией, парагриппом-3, хламидиозами и другими), обусловливает трудность клинической диагностики этой инфекции. Поэтому давно ощущается необходимость разработки и совершенствования методов ее лабораторной диагностики.
1.2. Диагностика инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота
Как ‘ известно, диагностика инфекционных болезней основывается на учете всего комплекса признаков взаимодействия микроорганизма с инфекционным агентом: это прежде всего клиническое проявление болезни, эпизоотологические данные, патологоанатомические изменения и, наконец, что имеет наиболее важное значение -лабораторная диагностика.
Исторически возможность лабораторной диагностики появилась, с внедрением в вирусологическую практику культур клеток, поскольку данный вирус кроме этой биологической системы (и, разумеется, чувствительного организма крупного рогатого скота) не удавалось и до сих пор не удается репродуцировать в условиях лаборатории. По существу, все лабораторные методы подчинены идее обнаружения и идентификации вируса или специфических антител.
Основными методами лабораторной диагностики ИРТ крупного ро-
II
гатого скота являются:
- выделение вируса в чувствительной культуре клеток с последующей его идентификацией в реакциях нейтрализации (PH) и иммунофлуоресценции;
- ретроспективная диагностика - обнарунение антител в реакциях нейтрализации (PH) и непрямой гемагглгатинации (РИГА).'
Вспомогательными методами диагностики являются: - выявление антигена вируса ИРТ с помощью иммунофлуоресценции мазков-отпечатков со слизистой носа, глаз и влагалища подозрительных по заболеванию и больных нивотных;
- реакция диффузионной преципитации в агаровом геле (РДП) с целью выявления антигенов и антител (7).
Выявление вируса ИРТ в чувствительной культуре клеток почки эмбриона крупного рогатого скота и его идентификация в этой системе впервые была показана Ма<Ип б.и. et а1. (1956) (138). Помимо первичной культуры клеток эмбриональной почки крупного рогатого скота используют культуру клеток легких и семенников.
Присутствие вируса инфекционного ринотрахеита в культуре клеток выявляют по его цитопатоген ному действию и идентифицируют в PH с заведомо полонительной сывороткой (29). Результаты PH оцениваются или по степени разведения сыворотки или индексу нейтрализации.
Признавая высокую специфичность этой реакции и достоверность ее показаний как при экспериментальной, так и полевой инфекции, нельзя не отметить ее трудоемкости для практических лабораторий и непременного наличия культуры клеток, что далеко не всегда доступно практическим врачам. С целью повышения производительности труда в диагностической работе исследователи пошли по пути усовершенствования этой методики. В настоящее время находит применение микрометод PH (85).
- Київ+380960830922