1. ВВЕДЕНИЕ...........................................................3
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..................................................10
2.1. Общая характеристика рода Mycobacterium Zehmann and Neumann, 1896,
сем. Mycobacteriaceae..........................................10
2.2. Некоторые вопросы изменчивости микобактерий.....................17
2.3. Ускоренные »методы микробиологической диагностики туберкулёза...24
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ..........................................41
3.1. Материалы и методы исследований.................................41
3.2. Метод экспрессной индикации и выделения микобактерий на плотных средах с жидким парафином............................................44
3.3. Совершенствование бактериологических методов исследования на туберкулёз........................................................... 56
3.4. Микрокультуры микобактерий в жидких средах накопления с твёрдым парафином............................................................67
3.5. Сравнение эффективности методов идентификации микобактерий 76
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ...............................98
5. ВЫВОДЫ...........................................................118
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.........................................124
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................125
2
1. ВВЕДЕНИЕ
1.1. Актуальность проблемы. Сложность и нестабильность эпизоотической обстановки по туберкулёзу практически во всех странах, значительное ухудшение эпидемиологической ситуации, утяжеление течения туберкулёзного процесса, всевозрастающее в последние годы число сообщений об увеличении количества заболеваний микобактериозами обусловили концентрацию внимания исследователей на проблемах дифференциации туберкулёза от других микобактериозов и совершенствования методов выделения и идентификации микобактерий туберкулёза (А.Л. Лазовская, 1999; Т.Ю. Салина с соавт., 2000; В.И. Голышевская с соавт., 2001; Е.М. Скрягина с соавт., 2001; P.A. Нуратинов с соавт., 2002).
Используемые в настоящее время традиционные микробиологические методы выявления и идентификации микобактерий (бактериоскопический и культуральный) по многим причинам не удовлетворяют практику. Бактсрио-скопический метод диагностики прост и экономичен, позволяет обнаружить микобактерии в диагностическом биоматериале в течение нескольких часов. Однако к недостаткам его следует отнести низкую чувствительность, невозможность дифференцировать и идентифицировать микобактерии в мазках, а также отличать живые и мёртвые бактериальные клетки.
Особую значимость для дифференциально-диагностических целей имеет культуральный метод - прямого посева, позволяющий выделить микобактерии туберкулёза в чистом виде из диагностического биоматериала, при наличии в нём всего нескольких десятков жизнеспособных особей возбудителя. Очень важным преимуществом метода культурального исследования является возможность подробного изучения изолированной культуры возбудителя, её идентификации и определения вирулентности и других биологических свойств.
Однако необходимо отметить, что существует ряд факторов, ограничивающих широкое применение культурального метода. Это, в частности, ог-
Микобактерии туберкулеза имеют различные ферменты. Так, ферменты эстеразы и липазы расщепляют жиры, что дает возможность микобактериям использовать их в качестве питательного материала. Дегидразы расщепляют органические кислоты, в том числе и аминокислоты. Уреазы расщепляют мочевину, перигалоза - углеводы, каталаза - перекись водорода. Проте-олитические ферменты расщепляют белок. Микобактерии ферментируют алкоголь, глицерин и многочисленные углеводы, лецитин, фосфатиды.
Патогенные микобактерии (возбудитель туберкулеза) содержат эндотоксины - туберкулины (285), которые проявляют токсическое действие только в больном организме. Жирные кислоты (масляная, пальмитиновая, туберкулостеариновая, олеиновая) способствуют распаду клеточных ферментов, творожистому перерождению тканей, блокируют липазу и протеазы, вырабатываемые микобактериями. Вирулентные микобактерии содержат полисахаридные компоненты, а также корд-фактор, обусловливающий вирулентность, склеивание микобактерий, что вызывает их рост в виде жгутов и кос.
Микобактерии туберкулеза содержат пол исахари до-бел ково-липоидный комплекс, названный полным антигеном. При парентеральном введении у животных наблюдают образование антител, которые выявляются с помощью серологических тестов: РА, РП, РСК и др. Туберкулины также относят к антигенам. В отдельности ни одна из фракций микобактерий туберкулеза (туберкулопротеиды, туберкулолипиды, туберкулополисахариды) не вызывает иммунологических сдвигов в организме. Образование антител вызывает только полисахаридо-липоидный комплекс, то есть полный антиген. Среди атипичных микобактерий различают общие и групповые антигены. Для их идентификации используют серологические методы, чаще метод диффузной преципитации в агаре по Оухтерлони. В стадии широкого испытания находятся реакция стимуляции лимфоцитов (РСЛ) и реакция задержки миграции лейкоцитов (РЗМЛ).
Туберкулезные микобактерии бычьего вида патогенны для многих животных (крупный и мелкий рогатый скот, свиньи, однокопытные, плотоядные
и др.). Из лабораторных животных наиболее чувствительны кролики и морские свинки, у которых развивается генерализованный туберкулез. Птичий вид микобактерий вызывает туберкулез у кур, индеек, цесарок, фазанов, голубей, уток и др. В естественных условиях птичьими микобактериями заражаются домашний скот и человек. Из лабораторных животных к этому виду чувствительны кролики.
Для идентификации микобактерий туберкулеза и дифференциации их от других медленно растущих микобактерий рекомендуется использовать набор биохимических признаков. Биохимический метод основан на том, что в процессе метаболизма микобактерии разных видов проявляют различную ферментативную активность. Наиболее популярными тестами биохимической дифференциации микобактерий являются: ниациновый тест, реакция восстановления нитратов, амидазная проба, каталазная и арилсульфатная активность, рост на среде с сапицилатом натрия, разрушение (дегидрация) са-лицилата натрия, ПАСК, гидролиз твин-80 и др.
В большинстве случаев нет необходимости доводить определение до уровня отдельных видов. Так, может оказаться достаточным идентифицировать микобактерии, как относящиеся к определенной группе сходных по клиническому воздействию на макроорганизм. В подобных случаях проведение сложных тестов для идентификации до вида может не быть оправдано ценностью получаемых сведений. По этой причине разработано и предложено для выбора много схем, включающих минимальное количество тестов, с учетом характерных для микобактерий признаков: кислотоустойчивость, скорость роста при первичном посеве и в субкультурах, пигментообразова-ние, рост на МПА, рост на яичных средах при различных температурах - 22 °С, 37-38 °С, 45 °С и в присутствии салицилового натрия.
Практическое значение микобактерий велико. Среди них имеются об-лигатно патогенные виды - возбудители туберкулеза и лепры; нетуберкулез-ные виды (представители групп I, II, III, IV Раниона, часто встречаются в природе) - возбудители микобактериозов; а также свободноживущие сапро-
16
- Київ+380960830922