м
2
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ........................................................ 3
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................. 9
1.1. Современные представления о молекулярно-клеточных механизмах инфекционного процесса при туберкулезе............... 9
1.2. Теоретические и экспериментальные основы хемилюминесценции биологических тканей......................... 16
1.3. Использование хемилюминесценции для диагностики
^ болезней человека и животных................................... 23
1.4. Заключение по обзору литературы 33
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.................................... 35
2.1. Материалы и методы................................... 35
2.2. Выделение клеток крови и определение условий их 43
максимальной хемилюминесценции............................
2.2.1. Способ выделения лейкоцитов.................... 43
2.2.2. Изготовление стабилизирующего раствора......... 46
2.3. Хемилюминссцснция иммунокомпетентных клеток крови
ф лабораторных животных, экспериментально зараженных М. bovis 49
2.4. Хемилюминесценция иммунокомпетентных клеток крови телят, экспериментально зараженных M.bovis..................... 56
2.5. Хемилюминесценция иммунокомпетентных клеток крови коров, экспериментально зараженных M.bovis..................... 69
2.6. Результаты испытания диагностической эффективности иммунохемилюминссцентного метода в производственных условиях .. 80
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.............................. 86
ВЫВОДЫ......................................................... 97
# ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ....................................... 99
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................. 100
ПРИЛОЖЕНИЕ.................................................... 122
ВВЕДЕНИЕ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В системе противотуберкулезных мероприятий решающая роль отводится диагностике, так как успех борьбы с этой антропозоонозной инфекцией во многом зависит от полного и своевременного выявления источников возбудителя болезни. Между тем, многолетний опыт использования традиционных методов диагностики туберкулеза выявил ряд свойственных им недостатков. Основной метод массовых аллергических исследований, туберкулиновая проба, не выявляет в стаде всех больных туберкулезом животных. Это вынуждает проводить многократные повторные исследования, что значительно затягивает сроки оздоровления неблагополучных стад (М.КЛОсковец, 1948, 1965, В.П.Урбан, 1982, 1998; Л.М. Ходун, 1985, 1987, 1988; А.С.Донченко, 1994, 2004;
Н.П.Овдиенко, 1997).
В то же время туберкулиновая проба нередко проявляется неспецифически у животных в заведомо благополучных хозяйствах. При исследовании животных в благополучных по туберкулезу пунктах в случае выявления реагирующих на ППД-туберкулин животных значительная их часть подлежит диагностическому убою и последующему исследованию в условиях ветлабораторий. Для дифференциальной диагностики в этих случаях применяют громоздкую, длительную по времени и дорогостоящую схему исследований: симультанную пробу с туберкулином для птиц или KAM, с последующим убоем и патологоанатомической экспертизой, бактериологическим и биологическим исследованиями биоматериала от убитых с диагностической целью животных (Л.М.Ходун, 1984; 1988; 1990;
A.X.Найманов, 1992; А.С.Донченко, 2000; В.Г.Ощепков, 2001, 2003).
В соответствии с действующими ветеринарными и санитарными правилами (1996 г.) при туберкулезе биоматериал от каждого убитого с диагностической целью животного высевают на твердые яичные
12
Следствием иммунологического взаимодействия аллергена с сенсибилизированными лимфоцитами является освобождение медиаторов замедленной аллергии, так называемых лимфокинов. Лимфокины по своей природе являются гликопротеидами, которые синтезируются и секретируются лимфоцитами после стимуляции специфическим аллергеном (или неспецифической стимуляции фитомитогеном). Вслед за освобождением медиаторов следуют явления клеточной инфильтрации и тканевого повреждения. В общем реакция характеризуется инфильтрацией, эритемой, а иногда некрозом. При этом гистологически наблюдаются следующие изменения: расширение капилляров с экссудацией жидкости и клеточных элементов, через 24 часа большую часть этих клеток составляют мононуклеарные лейкоциты (лимфоциты и макрофаги). Значительное количество этих клеток гематогенного происхождения. Только небольшая часть из них (10%) является специфически сенсибилизированной. Затем развиваются элементы тканевого повреждения, составляющие характерную черту аллергической реакции замедленного типа (М.М.Авербах, В.Я.Гергерт, В.И. Литвинов, 1974).
Наиболее мощным механизмом неспецифической защиты является фагоцитоз бактерий, осуществляемый с помощью полиморфноядерных клеток, обладающих значительной массой протоплазмы и выраженной амебовидной подвижностью, и моноядерных (макрофаги, циркулирующие моноциты крови, а также оседлые клетки в разнообразных тканях) фагоцитов (М.М.Авербах с соавт., 1976; Н.А.Радчук, 1991).
Роль фагоцитоза в становлении и развитии приобретенного иммунитета очень значительна в связи с активацией фагоцитов (макрофагов) за счет антител (опсонинов), комплемента и лимфоцитарных медиаторов, поэтому его принято называть иммунным фагоцитозом. Опсонины в иммунном фагоцитозе подготавливают поверхность фагоцитируемого объекта путем образования на ней иммунного комплекса, фиксирующего комплемент. В условиях приобретенного иммунитета иммунный фагоцитоз по
распознаванию приближается к уровню функции иммунокомпетентных клеток. Это происходит с помощью адаптированных энзимов. Макрофаги становятся носителями переработанных антигенов; переносят антигенную информацию Т- и В-лимфоцитам, участвуют в активации Т-клеток, взаимодействуют с лимфоцитами как в гуморальном, так и в клеточном иммунитете. Выделяемые Т-лимфоцитами медиаторы ГЗТ вовлекают в реакцию макрофаги, лимфоциты и нейтрофилы, а также клетки окружающей среды (Я.Е.Коляков, 1986; М.М.Авербах, 1976; Е.Л.Миллз и др., 1983).
В поддержании иммунного гомеостаза у больных туберкулезом большую роль играют нейтрофильные факторы естественной резистентности. Высокий уровень миелопероксидазы (МПО) и лактоферрина (ЛФ) в сыворотке крови расценивается как антиоксидантная защита организма, осуществляемая нейтрофильными гранулоцитами (С.АЬпзІгогп, 1961; К.ТакеБІ^е, Б.Міпакаті, 1987; В.Н.Гусева, В.М.Иванов, Е.И.Потапенко, О.Я.Якунова, Р.И.Шендерова, А.Е.Гарбуз, 2003).
Связывание микобактерий макрофагами может происходить через маннозный рецептор макрофагов, через рецептор к комплементу. Молекулы СД14 участвуют в связывании неопсонизированных микобактерий. Белок А сурфактанта может связывать М. туберкулозис и другие виды патогенных микобактерий, и выполнять функции опсоиина. Попав внутрь макрофага, живые вирулентные микобактерии способны блокировать слияние фагосом с лизосомами. Бактерицидные функции макрофагов осуществляются скорее всего внутри фаголизосом, в которых содержатся лизосомальные гидролазы, а также активные формы кислорода и азота (Н2О2, 02\ О, N02*) (МЛ.РепІоп, М.\У.Уегтеи1еп,1996).
Одним из ранних проявлений реактивности нейтрофилов служит активация кислородзависимого метаболизма, так называемый «кислородный взрыв», сопровождаемый образованием активных форм кислорода. С помощью НАДФ-оксидазной системы кислород окисляется до супероксидного радикала, который под влиянием супероксидисмутазы
- Київ+380960830922