СОДЕРЖАНИЕ
Стр.
Введение 5
Глава 1. Антигены цестод и гуморальный иммунный ответ хозяина
1.1. Литературная справка 12
1.1.1. Распространение цистицеркозов 12
1.1.2. Антигены цестод 22
1.1.3. Методы фракционирования полных антигенных Экстрактов 33
1.1.4. Культуральные методы получения антигенов 40
1.2. Собственные исследования 44
1.2.1. Материалы и методы исследований 44
Получение инвазионного материала: яиц тений и ли- 44
чинок паразитов
Приготовление соматических антигенов 46
Приготовление секреторно-экскреторных антигенов 47
Отбор метаболитов клеточных культур 48
Получение гинериммунных сывороток крови 51
Физико-химический и иммунохимический анализ ан- 51
ти генов
1.3. Результаты исследований 58
1.3.1. Водно-солевые экстракты цестод, их диагностиче- 61 ская ценность
Иммунодиффузия в ,гсль 65
Иммуноэлектрофорез 69
Электрофоретическое разделение водно-солевых экс- 72
трактов
Иммуноблоттннг 76
1.3.2. Экскреторно-секреторные антигены гельминтов 83
1.3.3. Метаболиты клеточных культур гельминтов 84
Фракции антигенных экстрактов при хроматографичс- 87
ских разделениях
Обсуждение результатов 92
Заключение по главе 1 118
Практические результаты 118
Теоретические положения 119
Глава 2. Естественная резистентность и особенности 121
клеточного иммунитета при цистицеркозах животных
2.1. Литературная справка 121
2.2. Материалы и методы исследований 144
2
Определение бактерицидной активности сыворотки 144
крови
Определение лизоцимной активности сыворотки крови 145 Определение комплемента 147
Исследование клеточных факторов иммунитета 149
Определение В-лимфоцитов (ЕАС-РОК) 150
Определение количества Т-лимфоцитов (Е-РОК) 150
Морфометрические исследования органов иммуногенеза 152
2.3. Результаты исследований 153
Изучение бактерицидной, лизоцимной и комплемен- 153
тарной активности сыворотки крови свиней и овец, экспериментально зараженных цистицеркозом Динамика иммунокомнетентных клетов в крови свиней 158
и овец, экспериментально зараженных цистицеркозом Иммуноморфологическис реакции в лимфоидных ор- 162
ганах при экспериментальном цистицеркозе свиней и овец
Морфометрический анализ динамики площадей струк- 170
турных компонентов брыжеечного лимфатического
узла
Морфометрический анализ динамики площадей струк- 176
турных компонентов селезенки
Морфометрический анализ динамики площадей струк- 181
турных компонентов тимуса
Спонтанная инвазия 189
Е-РОК, Т-хелперы, Т-супрессоры и ЕАС-лимфоциты в 189
крови при спонтанном цистицеркозе свиней и овец Результаты исследования динамики Е-РОК- 193
лимфоцитов, Т-хелперов, Т-сунрессоров при экспериментальном цистицеркозе крыс
Обсуждение результатов исследования 205
Заключение по главе 2 233
Практические результаты 233
Теоретические положения 238
Глава 3. Иммунодиагностика цистицеркозов и тениидо- 239
зов животных
3.1. Литературная справка 239
3.2. Собственные исследования 254
3.2.1. Материалы и методы 254
Постановка и учет результатов ИФР при цистицерко- 257
зах животных
Разработка дот-ИФР при цистицеркозах и тениидозах 258
животных
3
kDa обнаруживали антитела более поздней инвазии - до 200 дня после заражения (A.S. de Aluja et al, 1995).
Таким образом, сложность антигенной мозаики подтверждена многочисленными экспериментами ученых разных стран. Однако данные, на какие антигенные компоненты, какой стадии развития цестод вырабатываются антитела, получены низкочувствительными методами и являются противоречивыми. Не определены антигены гельминтов и гуморальные белки хозяина, способные перекрестно реагировать с циркулирующими в крови антителами. Не установлено, какого возраста личинки обладают максимальным количеством диагностически ценных компонентов. Не проведены сравнительные испытания иммунохимических тестов, характеризующие антителогенез при цистицеркозах у разных видов животных.
1.1.3. Методы фракционирования полных антигенных экстрактов
Водно-солевой экстракт гельминтов содержит большой диапазон растворимых веществ, которые могут обладать как диагностическими, так и протективными свойствами. Как правило, в него в большом количестве входят поверхностные и экскреторно-секреторные антигены (P.C. Шульц и Е.В. Гвоздев, 1976). Задачей иммунохимиков в гельминтологии является выделение белков, которые максимально эволюционировали и отличаются антигенной структурой от белков таксономически близких видов червей. Данные белковые молекулы должны поступать от паразита в организм хозяина и стимулировать выработку антител на всех этапах развития личинок, т. е. максимально длительное время. Пикантность данной задачи состоит в том, что эволюцией паразитов, скорее всего, поддерживаются одинаковые структуры разных видов гельминтов, которые не вызывают острых противоречий с иммунной системой хозяина, т. е. морфологически схожи с белками хозяина (П.Е. Игнатов, 2002).
33
Применяя разные соли и различные их концентрации в растворах, получают буфер, необходимый для растворения в нем определенных групп молекул. На первом этапе происходит фракционирование веществ по их растворимости в заданных условиях. При существующих способах первичной обработки тканей паразитов, таких как растирание, гомогенизация, ультразвуковая и химическая солюбилизация, происходит разрушение клеток, и из них в экстракт попадают внутриклеточные белки. Ткани и клетки содержат разные соли и несущие заряд - белки, фосфолипиды, нуклеиновые кислоты. Для получения перехода максимального количества веществ в экстракт используют буфер с ионной силой и pH, близким к физиологическим. Обычно применяют следующие буферные системы: 20-50 мМ фосфат, pH 7 - 7,5; 0,1 М трис-НС1, pH 7,5 и 0,1 М КС1. В буфер могут быть добавлены ЭДТА (1-5 мМ), р-меркаптоэтанол (5-20 мМ), а также специфические стабилизирующие агенты для определенных белков. При физиологических концентрациях солей можно получить из гомогената гельминтов до 40 % растворимых белков (Е. Soulsby, 1979). Белки паразитов, растворенные в фосфатно-солевом буфере, могут иметь определенные диагностические свойства и использоваться в иммунологических тестах (Papas M.G.; Cregory, 1961; Р.С. Шульц, Э.Х. Даугалиева, 1973). При физиологической концентрации солей растворимость является результатом полярного взаимодействия вещества с растворителем и его ионных взаимодействий с присутствующими солями.
При повышенной концентрации соли в растворе происходит процесс, который называется высаливанием белков. Высокая ионная сила раствора лишает молекулы белков гидратирующих оболочек, что приводит к агрегации и осаждению белка в осадок. Многие макромолекулы осаждаются из раствора в достаточно узкой области концентрации соли, что делает эту процедуру высокоэффективным методом фракционирования. На поверхности белка происходит агрегация гидрофобных участков. Вещества, содержащие большое количество гидрофобных аминокислотных остатков,
34
- Київ+380960830922