Разработка и совершенствование экспресс-метода индикации листерий

2
ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ..........................................................5
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................11
2.1. Возбудитель листериоза.......................................11
2.1.1. Морфология...............................................13
2.1.2. Подвижность..............................................14
у'.« 2.1.3. Культуральные свойства....................................14
2.1.4. Биохимические свойства...................................20
2.1.5. Антигенная структура.....................................22
2.1.6. Устойчивость.............................................23
2.2. Эпизоотология листериоза.....................................23
2.3. Диагностика..................................................32
2.3.1. Бактериологическое исследование..........................32
2.3.2. Идентификация возбудителя................................36
2.3.3. Серологическая диагностика...............................39
2.3.4. Биологическое исследование...............................40
2.4.Экспресс-методы для индикации бактерий........................40
2.5. Заключение по обзору литературы..............................48
3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.........................................49
3.1. Материалы....................................................49
3.1.1. Микроорганизмы...........................................49
1 3.1.2. Животные..................................................49
V. 3.1.3. Латсксы...................................................49
3.1.4. Антигены.................................................49
3.1.5. Сыворотки................................................50
3.1.6. Эритроцитарные диагностикумы.............................50
3.1.7. Питательные среды........................................50
3.1.8. Оборудование.............................................51
3.2. Методы.......................................................51
3.2.1. Микроскопическое исследование............................51
3.2.2. Посевы на питательные среды..............................51
3.2.3. Идентификация культур по культурально-морфологическим, биохимическим и серологическим свойствам........................51
3.2.4. Биологическое исследование...............................52
3.2.5. Определение количества общего белка......................53
3.2.6. Получение сывороток......................................53
3.2.7. Выделение иммуноглобулинов из сывороток крови животных .53 •*' 3.2.8. Изготовление эритроцитарного диагностикума и постановка
РИГА............................................................54
3.2.9. Статистическая обработка результатов.....................55
3.3. Результаты исследований......................................56
3.3.1. Изучение биологических свойств л истерий, используемых в работе..........................................................56
3.3.2. Получение компонентов латексных диагностикумов...........58
3
3.3.3. Разработка латексного антителыюго диагностикума и техники постановки PJIA..................................................62
3.3.4. Постановка РЛА с латексным антительным д на гн ости кум ом... 65
3.3.5. Оценка активности, специфичности, чувствительности и стабильности латексного антительного диагностикума...............68
3.3.6. Постановка «пластинчатой» реакции латекс агглютинации 70
•у 3.3.7. Сравнительная оценка эритроцитарного и латексного
антителыюго диагностикумов при исследовании антигенов в РЛА и РИГА.............................................................71
3.3.8. Разработка латексного антигенного диагностикума и постановки РЛА..............................................................73
3.3.9. Постановка РЛА с латексным антигенным днагностикумом 75
3.3.10. Оценка активности, специфичности, чувствительности и стабильности латексного антигенного диагностикума................79
3.3.11. Сравнительная оценка латексного и эритроцитарного антигенных диагностикумов при исследовании сывороток в РЛА и РИГА.............................................................81
3.3.12. Использование РДП для индикации листерий.................83
3.3.13. Индикация листерий в патологическом материале, объектах окружающей среды, пищевых продукгах..............................85
к СХЕМА ИНДИКАЦИИ ЛИСТЕРИЙ...............................................86
3.3.14. Выявление АТ в РЛА как дополнительный метод
серологической диагностики листериоза............................98
3.3.15. Определение листерий с помощью ИФА......................100
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ...........................................103
5. ВЫВОДЫ...........................................................111
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.........................................112
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................113
8. ПРИЛОЖЕНИЯ.......................................................125
%
домашних птиц; в 1934 году Джонс и Литль [8] - при энцефалите у крупного рогатого скота; в 1939 - 1940 годах Грахем, Хистер и Левин [6, 63, 136] - из абортированного плода коровы.
Первое сообщение о листериозе человека связывают с наблюдениями Аткинсона [6, 56, 136], который в 1915 году зарегистрировал в Австралии эпидемию детского паралича и выделил при этом культуру, дифтерийно-подобных бактерий, и с работами Дюмонта и Котони [6, 56, 136], выделивших в 1918 году из спинномозговой жидкости солдата, больного менингитом, культуры микробов, которые 20 лет спустя были идентифицированы Патерсоном как листерии.
Вид L. monocytogenes в единственном числе представлял род Listeria до 1961 года, когда он постепенно пополнился видами L. denitrificans (1961), L. grayi (1966) и L. murray (1971). Все штаммы серовара 5 листерий обладали сильной гемолитической активностью и были выделены в отдельный вид L. bulgarica болгарским исследователем Ивановым в 1975 г. Вид получил окончательное название L. ivanovii в 1984 году. Непатогенные штаммы L. monocytogenes, относившиеся к серовару 6, были выделены в новый вид L. innocua. В 1983 г. род листерий пополнился еще двумя видами: L. vvelshimeri и L. seeligeri, таким образом, количество видов достигло максимального значения 8 [60, 133, 137]. Однако применение принципов нумерической таксономии, изучение гомологии нуклеотидных последовательностей и 16 SrPHK сократило количество видов до 6 [60, 133, 138].
L. denitrificans существенно отличается от других видов листерий и выделена в самостоятельный род Jonesia. Аналогичная попытка выделить в новый род Murrayi два других генетически отличающихся вида листерий -L. grayi и L. murrayi с образованием двух подвидов М. grayi и М. grayi subsp. murrayi не увенчалась успехом. В результате вид L. murrayi стали рассматривать в качестве подвида L. grayi [60, 137, 139].
В настоящее время известно 7 видов листерий: L. monocytogenes, L. seeligeri, L. welshimeri, L. innocua, L. ivanovii, L. grayi, L. Grayi subsp. murrayi,
но только L. monocytogenes патогенна для человека и животных, a L. ivanovii -для животных [133]. Было показано, что род Listeria достаточно далеко филогенетически отстоит от рода Eiysipelothrix [60,117,133].
2.1.1. Морфология
Возбудитель листсриоза Listeria monocytogenes — это маленькая палочковидная бактерия. Наиболее типичной является форма в виде палочки с закругленными концами, длиной 0,5-2,0 мкм и шириной 0,3-0,5 мкм.
Однако листериям свойственна значительная полиморфность: в
зависимости от условий культивирования они способны принимать кокковидную или овоидную формы, а также форму коринебактерий, энтерококков, стрептококков. В старых культурах и, нередко, в патологическом материале обнаруживаются очень мелкие коккообразные формы листерий.
В мазках листерии обычно располагаются по одиночке, парами, параллельно друг другу - палисадником (частоколом), небольшими (в 3 - 4 клетки) цепочками или в виде римской цифры V.
Листерии хорошо окрашиваются всеми анилиновыми красками, по Граму - положительно (темно-фиолетовый цвет). Некоторыми авторами [6, 56, 136] отмечалось биполярное окрашивание листерий. Зеелигер [136] связывает это явление с различной скоростью обесцвечивания средней части и концов микробной клетки. Грамположительная окраска свойственна, как правило, молодым культурам листерий. В 4 - 5 дневных культурах старые клетки легко обесцвечивается спиртом и поэтому окрашивается грамотрицательно, а с 14-го дня почти все клетки в культуре листерий окрашиваются грамотрицательно [6].
В листериях не обнаружено включений серы, железа, жира, не выявлено наличия митохондрических зерен (волютина). Кислотоустойчивостыо листерии не обладают, спор и капсул не образуют.
Электронно-микроскопические исследования показали, что микробные клетки листерий имеют следующие компоненты: клеточную стенку,
цитоплазменную оболочку, внутрицитоплазматические мембранные системы, цитоплазму, ядерный аппарат [6, 56, 136].