2
Содержание
Стр.
1. Введение 7
2. Обзор литературы 9
2.1. Бактериальные токсины 9
2.1.1. Классификация 9
2.1.2. Строение 15
2.1.3. Распространение среди микроорганизмов 17
2.2. Генетика токсинообразования у Escherichia coli 24
2.2.1. Строение генов 24
2.2.2. Роль горизонтального обмена генетическим материалом в формировании токсического фенотипа 26
* 2.3. Борьба с токсикоинфекциями и роль вакцинопрофи-
, лактики 30
2.3.1. Современные вакцины 30
2.3.2. Особенности противотоксических вакцин 33
3.3.3. Биологическая безопасность вакцин 37
3. Материалы и методы 39
3.1. Получение препаративных количеств плазмидной
ДНК 39
3.1.1. Культивирование штаммов Е. coli 39
3.1.1.1. Использовавшиеся штаммы Е. coli 39
3.1.1.2. Использовавшиеся плазмиды 41
3.1.1.3. Среды для культивирования микроорганизмов 43
3.1.2. Трансформация штаммов Е. coli плазмидной ДНК. 43
3.1.3. Выделение и очистка плазмидной ДНК 44
3.1.4. Электрофорез в агарозном геле и визуализация плазмидной ДНК 44
3
3.2. Клонирование генов
3.2.1. Расщепление плазмидной ДНК рестриктирующими
эндонуклеазами
3.2.2. Выделения нужных' фрагментов плазмидной ДНК из агарозных гелей
3.2.3. Обработка фрагментов ДНК нуклеазой SI
3.2.4. Лигирование вектора со вставкой
3.4. Получение делении в гене.
3.5. Отбор штаммов, содержащих конъюгативные плазмиды.
3.6. Введения вектора в бактерии-реципиенты с помощью мобилизации
3.6.1. Постановка триродителского скрещивания на плотной среде
3.7. Реакция двойной иммунодиффузии в агаровом геле по методу Ухтерлони.
3.8. Оценка токсичности штаммов E. coli
3.9. Оценка протективной активности потенциально вакцинного штамма
4. Результаты
4.1. Клонирование оперона полноразмерного LT в плазмиду pBR322
4.2. Клонирование детерминант А-субъединицы LT и В-субъединицы LT в плазмиду pBR322
4.3. Введение делеции в А-субъединицу полноразмерного LT
4.4. Конструирование штамма E. coli, содержащего детерминанту токсоида LT и систему рестрикции-модификации
45
45
45
46
46
47
47
48
48
50
50
51
52
52
53
55
57
классификации, в основе которой лежали два критерия: степень связи токсина с микробной клеткой и механизм поражающего действия. По степени связи с микробной клеткой авторы различают экзотоксины, ме-зотоксины и эндотоксины. Токсические продукты секретируемые в окружающую среду и несвязанные со стромой микробной клетки названы экзотоксинами. Токсические вещества, имеющие непрочную связь с микробной клеткой, и частично выделяемые в процессе жизнедеятельности в среду культивирования названы мезотоксинами. Токсины прочно связанные со стромой микробной клетки и попадающие в культуральную среду после лизиса клетки названы эндотоксинами. По механизму действия авторы разделяют токсины на четыре основных типа:
1) мембранотоксины;
2) цитотоксины;
3) функциональные блокаторы;
4) эксфолиатины и эритрогенины.
Мембранотоксины воздействуют на поверхностную мембрану клетки. Цитотоксины повреждают внутренние компоненты клетки. Функциональные блокаторы модифицируют функциональную активность клетки. Эксфолиатины и эритрогенины влияют на процесс взаимодействия клеток между собой и с межклеточным веществом.
К мембранотоксинам авторы относят лейкошшшы, гемолизины и токсины с фосфатидазной активностью. Гемолизины подразделяют на группу инактивируемую кислородом, но активируемую цисте ином и группу резистентную к действию кислорода. К цитотоксинам относят антиэлонгаторы, токсины с энтеротропной активностью и цитотоксины-дерматонекротизины. К функциональным блокаторам относят нейротоксины, энтеротоксины и токсины, инактивирующие цАМФ. Энтеротоксины авторы подразделяют на термолабильные и термостабильные.
Таким образом, при классификации токсина авторы учитывали, с одной стороны, степень его связи с микробной клеткой, а с другой стороны, механизм повреждающего действия.
Finlay В. В. и Faiklow S. (Finlay В. В., 1997) попытались сгруппировать токсины на основе общности структуры и биохимических свойств. Они выделили четыре группы:
1. A-В токсины;
2. Протеолитические токсины;
3. Пороформирующие токсины;
4. lg А протеазы;
5. Термостабильные токсины;
6. Токсины, изменяющие цитоскелет.
A-В токсины состоят из двух компонентов: А-субъединицы и В-субъединицы. В-субъединица (субъединицы) отвечает за связь токсина с рецепторами находящимися на поверхности клеток макроорганизма и способствует внедрению токсина в клетку хозяина. Структура В-домена сильно отличается у различных токсинов, благодаря этому обеспечивается специфическое связывание токсина с рецепторама и соответственно тропность токсина к определённым тканям и видам макроорганизмов. А-субъединица обладает энзиматической активностью, которая проявляется в клетке хозяина. Энзиматическая активность А-субъединицы у различных токсинов варьирует от ADP-рибозилирующей активности (холе-роген, коклюшный токсин, дифтерийный токсин, термолабильный токсин Escherichia colit экзотоксин A Pseudomonas) до протеолитической активности (столбнячный и ботулинистический токсины). Однако структура А-субъединицы у различных токсинов, обладающих одинаковой ферментативной активностью, достаточно консервативна. Наиболее консервативны участки критические для ферментативной активности. Коклюшный токсин, дифтерийный токсин, холероген, термолабильный ток-
- Київ+380960830922