РОЗДІЛ 2
Загальна методика і основні методи досліджень
2.1. Матеріали і методи досліджень
Експериментальна частина роботи виконана на кафедрі ветеринарно-санітарної та
радіологічної експертизи Львівської державної академії ветеринарної медицини
імені С.З. Гжицького протягом 1999-2001 років.
Комплексна робота включає:
1. Вивчення за допомогою атомно-абсорбційного спектрофотометра типу ААS-30
(Бріцке М.Є., 1980) мінерального складу раціону тварин (коренебульбоплодів,
соковитих, зернових, концентрованих, грубих кормів і води) у господарствах
розміщених поблизу активно-промислових зон: агрофірми ”Бовшів” Рогатинського
району Івано-Франківської області, ССП “Нове життя” і ССП “Волсвинське”
Сокальського району, ССП імені Івана Франка Миколаївського району Львівської
області, а також ТзОВ “Літинське” Дрогобицького району Львівської області, що
знаходиться в екологічно безпечній зоні.
Модельні експерименти:
– на мітохондріях і мікросомально-цитозольній фракції печінки;
– культурі клітин гранульозного шару фолікулів яєчника (гранульоза).
Для досліджень, після забою тварин відбирали проби тканини печінки (10-15 г) та
проводили виділення мітохондрій (процедура проведена при tо + 4 0С) за методом
Р.П. Виноградова, Н.Е. Кучеренко, А.Р. Литвиненко (1977). Проби промивали 0,25
М розчином сахарози з 0,001 М розчином NаЕДТА (рН=7,4). Подрібнену та промиту
тканину гомогенізували протягом 30-40 сек у гомогенізаторі Поттера з 40 мл
середовища. Гомогенат центрифугували (600 g; 10 хв ). Супернатант, відділений
від осаду, центрифугували при 14000 g 10 хв. Одержаний осад суспендували в 0,25
М розчині сахарози і повторно центрифугували (14000 g; 10 хв). Утворений
щільний осад суспендували в 1 мл 0,25 М розчину сахарози. Для мітохондрій
субстратами окислення були сукцинат (кінцева концентрація в пробі 10 мМ) та
суміш: глутамат (5мМ) + малат (5мМ).
Для одержання мікросомально-цитозольної фракції подрібнену тканину печінки
гомогенізували 30-40 сек. у гомогенізаторі Поттера та центрифугували при 14000
g 10 хв, осад відділяли. Процедуру повторювали. Для досліджень використовували
0,1 мл супернатанту.
Для інкубації мітохондрій печінки та компонентів мікросомально-цитозоль-ної
фракції використовували середовище: 0,15 М сахарози, 0,015 М калію хлористого,
0,005 М калію фосфату. Одержаний результат виражали у нг-атом О/0,1 мл
суспензії за хв.
Для пригнічення реакцій перекисного окислення ненасичених жирних кислот у
комірку полярографа додавали 0,6 мМ NаЕДТА. Різниця між інтенсивністю
поглинання кисню до та після внесення NаЕДТА, свідчила про активність
перекисних процесів у тканині печінки.
Інтенсивність поглинання кисню визначали полярографічним методом у
термостатованій кюветі (t 380С). Для встановлення впливу кадмію на
кисень-залежні процеси у проби вносили CdCl2 у дозах, з розрахунку на кінцеву
концентрацію чистого металу, 1нг/мл; 10 нг/мл; 100 нг/мл; 1 мкг/мл; 10 мкг/мл.
З метою виявлення процесів, що ведуть до порушення метаболізму та появи змін у
клітині за дії кадмію, використано біологічну модельну тест-систему – культуру
клітин гранульозного шару фолікулів яєчника корів. У тварин, після забою,
відбирали яєчники та шляхом аспірації фолікулів, отримували фолікулярну рідину
з клітинами. Центрифугували (2000 об хв), декантували, суспендували у
фосфатно-сольовому буфері. Культивування клітин гранульози проводили 10 –12 год
разом з хлоридом кадмію у середовищі RPMI – 1640 ( Flow Laboratories) за
загальновживаним методом (Голубєва А.К.,1989).
Для встановлення особливостей впливу кадмію на окремі ланки генерації АТФ і
процеси, які обумовлюють споживання кисню досліджували інтенсивність дихання
культури клітин гранульози. При цьому, вносили в середовище інкубації CdCl2 у
дозах, з розрахунку на кінцеву концентрацію чистого металу, 1 нг/мл, 10 нг/мл,
100 нг/мл, 1 мкг/мл, 10 мкг/мл та використовували інгібітори: гліколізу –
натрію фторид (10 –3 M); НАД-залежної ділянки дихального ланцюга – амітал (5.10
–3 М); термінальної (цитохромоксидази) – натрію азид (5.10 –3 М);
вільнорадикального окислення жирних кислот – NaEДTA (6.10–4 М).
З метою пошуку ефективних сполук, які здатні нівелювати токсичний вплив кадмію,
апробовували іn vitro суміш мікроелементів у формі хелатних сполук з
амінокислотою метіоніном. У зв’язку із встановленням попередніми дослідженнями
у кормах дефіциту кобальту, міді, цинку, марганцю та пониженим їх вмістом у
крові відгодівельного молодняку агрофірми “Бовшів” розроблено премікс №1
складовими якого були метіонати: кобальту (0,03 мкг/мл), міді (0,05 мкг/мл),
цинку (0,05 мкг/мл) та марганцю (0,05 мкг/мл). Вміст заліза у кормах дослідного
господарства був в межах норми, проте у крові бугайців виявлено нестачу
мікроелементу, тому до складу преміксу № 2 додатково включено метіонат заліза
(0,025 мкг/мл).
Культуру клітин інкубували протягом 12 годин в присутності преміксів та різних
доз кадмію (вносили CdCl2 у дозах, з розрахунку на кінцеву концентрацію чистого
металу, 1нг/мл; 10 нг/мл; 100 нг/мл; 1 мкг/мл; 10 мкг/мл). Проводили візуальну
оцінку забарвлення середовища (інтенсивний ріст і розвиток клітин
супроводжувався зміною рН середовища інкубації, про що свідчила зміна
забарвлення індикатора фенолового червоного) і досліджували інтенсивність
дихання гранульози за дії кадмію на фоні металоорганічних преміксів.
Апробація ефективності застосування БАР для виробництва високоякісної
екологічно безпечної продукції тваринництва.
Дослідження впливу БАР проводили у двох господарствах з різною інтенсивністю
техногенного навантаження – агрофірмі “Бовшів” (розміщена поблизу Бурштинської
ТЕС; вміст Cd у
- Київ+380960830922