РОЗДІЛ 2
2.1. МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Робота виконувалась протягом 1997-2002 років на кафедрі лабораторної діагностики інфекційних захворювань сільськогосподарських тварин Білоцерківського державного аграрного університету і в господарствах Київської області.
Схема досліду показана в таблиці 2.
Розповсюдження захворювання туберкульозом великої рогатої худоби в господарствах Київської області та причини повторних спалахів вивчали методом ретроспективного аналізу. Ретроспективний аналіз провели за 20 років (1979-2000 роки) на підставі узагальнень матеріалів відділу по боротьбі з туберкульозом Київського державного підприємства по боротьбі з хворобами тварин, даних м'ясокомбінатів та власних досліджень.
Відомості про виділені культури мікобактерій із патологічного матеріалу від великої рогатої худоби із господарств України отримані із Центральної лабораторії України та власних досліджень при діагностичних забоях тварин.
Матеріалом для досліджень була велика рогата худоба із благополучних та неблагополучних щодо туберкульозу господарств Білоцерківського, Володарського, Миронівського, Сквирського, Ставищенського та інших районів Київської області.
При цьому проводили комплексне діагностичне дослідження з використанням імунологічних реакцій: визначення функціонального стану Т- і В- систем лімфоцитів, алергічних, РГМЛ, РНГА, реакції алергічної альтерації, ІФА, а також патолого-анатомічних, бактеріологічних і біологічних методів дослідження відібраного матеріалу від тварин, реагуючих на туберкулін і забитих з діагностичною метою. Окрім того, досліджували проби грунту із місць утримання худоби з метою виявлення збудника туберкульозу в довкіллі.
При виконанні роботи алергічно обстежено 2933 гол. великої рогатої худоби; в РНГА з різними еритроцитарними алергенами досліджено 1663 гол.;
в РГМЛ - 60 гол.; визначено вміст Т- і В- лімфоцитів в периферійній крові - 60 гол.; досліджено сироваток крові в ІФА - 117 гол.; в РАлА - 20 гол.
При виконанні роботи використано 52 кролі і 14 морських свинок.
Алергічні дослідження проводили згідно з "Настановою по використанню туберкулінів для алергічної діагностики туберкульозу у ссавців та птиці " затвердженою ГУВМО МСГМ України 20 травня 1994 року.
2.2. Визначення функціонального стану Т- і В - систем лімфоцитів
Оцінку реактивності організму великої рогатої худоби, хворої на туберкульоз та здорової проводили шляхом визначення вмісту загальної і абсолютної кількості Т- і В- лімфоцитів за методикою Д.К.Новикова і В.И.Новиковой [95].
Активну субпопуляцію Т- лімфоцитів (Т- активні лімфоцити), які несуть хелперну функцію, визначали за методикою В.В.Меньшикова с соавт. [235].
2.3. Визначення індексу міграції лейкоцитів
Для визначення функціонального стану Т- системи лімфоцитів використовували реакцію гальмування міграції лейкоцитів (РГМЛ).
Суть методу полягає у тому, що in vivo сенсибілізовані мікобактеріями туберкульозу чи атиповими мікобактеріями лімфоцити при повторному in vitro додаванні до них специфічного алергену виділяють лімфокіни - медіатори, які затримують міграцію лімфоцитів.
При проведенні експериментальних досліджень на лабораторних тваринах у кролів, інфікованих різними видами збудників туберкульозу та Myc. fortuitum, вранці, до годівлі брали кров із крайової вени вуха. При проведенні досліджень у виробничих умовах у великої рогатої худоби брали кров із яремної вени. Кров набирали в пробірки, попередньо додавши в них розчин гепарину з розрахунку 25 ОД на 1 мл крові. РГМЛ ставили капілярним методом за методикою В.М.Івченко із співав. [232] в нашій модифікації.
Перед постановкою досліду кров обережно, ретельно перемішували і по 0,15 мл кожної проби наливали в окремі пробірки Флоринського, а далі додавали такі ж об'єми попередньо діалізованих проти дистильованої води та приведених в ізотонічний стан за допомогою х/ч солі хлористого натрію за методикою Савченко П.Е. [14], розведених 1 : 75, алергенів: ППД для ссавців, птахів, КАМу. Для постановки контролю використовували середовище 199. Пробірки термостатували при температурі 370 С 30 хв. Після інкубації вмістиме пробірок ретельно перемішували і отриманою суспензією наповнювали по 3-и тонких капіляри довжиною 70 мм і діаметром 0,6 мм. Кожна проба досліджувалась в 3-ох повторностях. Один кінець капіляра запаювали цементом "Вісфат". Наповнені капіляри центрифугували у вертикальному положенні при 3 тис. об./хв. 20 хвилин. Після закріплювання капілярів на предметних скельцях у горизонтальному положенні, вимірювали довжину осаду форменних елементів крові у них під мікроскопом МБС-9 за допомогою градуйованої шкали. Предметні скельця із капілярами поміщали у вологу камеру і залишали в термостаті при температурі 370С на 24 години. Після цього знову вимірювали довжину стовбчиків форменних елементів крові у капілярах під мікроскопом.
Індекс міграції лейкоцитів (ІМ) визначали за формулою:
Індекс міграції лейкоцитів вважається позитивним при значеннях показників 0,8 і нижчих.
2.4. Методика постановки РНГА
Для виявлення специфічних антитіл в сироватці крові тварин використовували реакцію непрямої гемаглютинації (РНГА).
РНГА ставили в полістеролових планшетах за видозміненою методикою М.О.Биргера [231] у нашій модифікації, суть якої полягала в підготовці алергенів для сенсибілізації еритроцитів барана, в якості яких використовували туберкулін ППД для ссавців, для птахів та КАМ.
Приготування алергену. Вміст ампул кожного виду туберкуліну об'ємом по 30 мл виливали в окремий поліетиленовий мішечок. Щільно зав'язували і ставили для діалізу проти дистильованої води - спочатку під проточну воду на 48 годин, потім - на добу в дистильовану воду зі зміною її через кожні 6 годин. Після цього, вмістиме мішечків зливали в стерильні пляшечки, які закривали ватно-марлевими корками і прогрівали на кип'ячій водяній бані пр