РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1. Матеріали досліджень та умови проведення дослідів
В проведених експериментах ми використовували рослини двох видів: Arabidopsis thaliana (L.) Heynh (різушка Таля) та Medicago sativa L. (люцерна посівна, сорт "Ольга"). Насіння A. thaliana було отримане від Lehle Seeds (Tucson, AZ); насіння люцерни було люб'язно надане Інститутом землеробства НАН України. Вищезгадані рослини мають ряд переваг:
Паростки A. thaliana зручні для лабораторних досліджень, а саме: на невеликій площині чашки Петрі (92x16) можна розмістити 20-30 рослин. Отже, розміри
A.thaliana дають можливість вирощувати його в чашках Петрі або в пробірках, тобто в "портативному" вигляді, що дозволяє здійснювати опромінення рослини в будь-якій фазі її життєвого циклу на лабораторних джерелах випромінення [34]. Відносно малий розмір паростків A.thaliana дозволяє коректно проводити експерименти з застосуванням УФ-радіації, однією з фізичних особливостей якої є значне розсіювання випромінення в товщі тканини [41].
До того ж, A.thaliana достатньо добре вивчений в радіобіологічному відношенні і використовувався як експериментальний об'єкт у багатьох дослідженнях [34, 98, 108, 124, 135, 138]. Для цього виду отримані мутанти, дефектні щодо репарації ДНК, які характеризуються підвищеною чутливістю до впливу УФ-випромінення.
У 1993 році A. N. Britt виділила УФ- гіперчутливий мутант A. thaliana uvr2-1
[100]. Був також ідентифікований та охарактеризований інший мутант A. thaliana - uvh1, гіперчутливий до впливу УФ-радіації та гамма-випромінення [111, 118, 127].
У обох випадках гіперчутливість до впливу УФ-випромінення зумовлена дефектами у системі репарації ДНК.
Мутант A. thaliana uvr2-1 є дефектним щодо фоторепарації ЦПД. Мутанти даного типу не здатні до видалення димерів з ДНК. В екстрактах, виділених з клітин uvr 2-1, спостерігалась відсутність фотоліазної активності, що є наслідком наявності структурної рецесивної мутації гена phr1 [100, 147].
При дослідженні мутанта A. thaliana uvh1 було встановлене значне підвищення стійкості рослин uvh1 до високих доз УФ після впливу видимого світла. З цих спостережень був зроблений висновок, що uvh1-мутант, можливо, дефектний по процесу ексцизійної репарації ДНК. Подальші дослідження uvh1-мутанта підтвердили це припущення виявленням його гіперчутливості до впливу ?-випромінення [127].
Нещодавно було клоновано один із генів A. thaliana uvh1/At RAD1 та ідентифіковано генний продукт uvh1, який виявився гомологом протеїнів: XPF у людини і RAD1 у Saccharomyces cerevisiae, котрі кодують репараційні ендонуклеази, що беруть участь у ексцизійній репарації ДНК. Продукт гену AtRAD1 є компонентом репараційної ендонуклеази, що приймає участь в ексцизії УФ пошкоджень. Стійкість до впливу УФ-випромінення організмів, що мають у своїй структурі RAD1/XPF гени, залежить від видалення фотопошкоджень шляхом ексцизійної репарації. Автори роботи [127] вважають, що рослини використовують даний тип репарації для видалення ушкоджень, індукованих УФ-випроміненням, подібно S. cerevisiae та деяким іншим організмам.
Отже, експериментальні дані [100, 111, 118] стосовно різних мутантних ліній A.thaliana, є корисними для подальшого аналізу значення функціонування репараційних систем клітини в розвитку РАВ у рослин. Проте, в зв'язку з тим, що мета наших досліджень полягала в вивченні РАВ дикого штаму, який не є дефектним щодо репараційних процесів, мутантні лінії в експериментах не використовувалися.
Для підтвердження думки, що РАВ, індуковану УФ-В випроміненням, можна вважати загальнобіологічним явищем ми використали іншого представника квіткових рослин - люцерну посівну (Medicago sativa L). Ця рослина невибаглива щодо умов культивування, часто використовується в наукових експериментах по дослідженню впливу ультрафіолетового випромінення на функціонування систем репарації ДНК рослин та добре вивчена в радіобіології рослин [20, 138, 139].
Насіння А.thaliana стерилізували в суміші 96% етанолу и 3% H2O2 (1:1) протягом 5 хв, після чого висаджували на поживне середовище Ленгріджа-Квітко в пластикові чашки Петрі по 20-25 рослин на чашку.
Склад поживного середовища Ленгріджа-Квітко:
1л. дистильованої Н2О
5% Na-ЭДТА-1мл
Солі макроелементів, (г):
KNO3 -1
MgSO4 ?7Н2О-0,15
FeSO4? 7H2O-0,07
Ca(NO3) 2? 4H2O-0,15
K2HPO4-0,15
Солі мікроелементів - 0,5 мл розчину даного складу (%) :
Н3ВО3-0,29
ZnSO4-0,025
MnSO4 ?7H2O-0,18
CuSO4? 5H2O-0,01
(NH4)6 Mo7O24-0,1
Агар-агар -8-10гр
Чашки розміщували в термостаті з верхнім освітленням, фотоперіод - світло 18-20 годин, темрява 4-6 годин. Температура при світлі 22оС, в темряві 20 оС. Відносна вологість повітря 70-80%.
Насіння люцерни Medicago sativa L. скарифікували згідно [35], після чого пророщували протягом трьох діб (7 - 10 рослин на чашку Петрі) за аналогічних умов.
2.1.1. Умови опромінення. Для дослідження РАВ за умов поєднання впливу рентгенівського та УФ-В випромінень, триденні паростки A. thaliana були розділені на 6 експериментальних груп: :
1 групу паростків складали контрольні неопромінені рослини;
2 групу паростків опромінювали на установці "Исследователь" (Росія) гамма-променями 60Co з потужністю дози (4,3 - 4,6 x 10-2 Гр/с) та рентгенівським випроміненням на приладі РУМ-17 (Росія) (потужність дози 0,43 сГр/сек), в інтервалах доз 0,4 - 40 Гр з метою з'ясування значень Д1 та визначення напівлетальної дози (ЛД50), яку в подальшому використовували як тестувальну;
3 групу паростків опромінювали в діапазоні доз УФ-В (0,002 -4,1 кДж/м2), внаслідок чого була виявлена ЛД50 для УФ-В, яку в подальших експериментах використовували як тестувальну дозу. Опромінення проводили за допомогою лампи " Philips" TL20W/12 (Німеччина);
4 групу паростків опромінювали рентгенівськими променями в дозах 0,4-0,7 Гр, потім через певні проміжки часу піддавали впливу тестуваль