Прогностичні фактори, що впливають на перебіг та результати програмної терапії ГЛЛ-ДГЛУ 93/95 у дітей з гострою лімфобластною лейкемією.

РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Характеристика хворих
Обстежено 125 дітей із вперше діагностованою ГЛЛ, які знаходились на лікуванні
у гематологічному відділенні Обласної дитячої спеціалізованої клінічної лікарні
(ОДСКЛ) міста Львова. Хворі поступали вперше у відділення з 1 лютого 1993 р. до
5 липня 2001 р. Контроль за віддаленими результатами припинено 1 жовтня 2003 р.
У дослідження не включали дітей, що вибули з-під нагляду через відмову батьків
продовжувати хіміотерапію та хворих, що до початку програмної терапії
отримували цитостатики/преднізолон. Оскільки таких дітей протягом зазначеного
часу було лише 6, то їх виключення не впливало на оцінку характеристик
захворювання.
Діагноз гострої лейкемії встановлювався на підставі клінічної картини, даних
аналізу периферичної крові, цитологічного дослід­ження стернального пунктату
(відсоток бластів > 25,0 % усіх нееритро­їдних клітин), а лімфоїдну належність
кісткового мозку і крові бластів виявляли за допомогою морфологічного та
цитохімічного досліджень.
Серед обстежених було 72 хлопчики (57,6 %) та 53 – дівчинки (42,4 %). Медіана
віку пацієнтів становила 5 років 8 міс. (коливання від 3 міс. до 15 років 8
міс.), в тому числі медіана віку хлопчиків була 5 років 7 міс. (коливання 3
міс. – 15 років 7 міс.) і дівчаток 5 років 8 міс (9 міс. – 15 років 8 міс.)
(табл. 2.1). Серед них переважали діти віком від 1 до 6 років – 65 осіб
(52,0 %), менш чисельними були групи хворих віком старших за 6 років – 56
(44,8 %) пацієнтів. Дітей до одного року було четверо (3,2 %).
Таблиця 2.1
Розподіл хворих ГЛЛ за статтю та віком
Стать
Вік
<1 р.
?1<3 р.
?3<6 р.
?6<9 р.
?9<12 р.
?12 р.
Всього
Хлопчики
19
16
15
11
72
Дівчатка
12
18
53
Всього
31
34
23
15
18
125
2.2. Методи дослідження
У роботі застосовано загальноклінічні (наявність збільшених лімфатич­них
вузлів, печінки, селезінки, екстрамедулярних пухлинних інфільтратів, проявів
нейролейкемії, анемічного та геморагічного синдромів, інфекційних ускладнень),
цитологічні (підрахунок гемограми та мієлограми, цитозу ліквору, у препаратах,
виконаних на цитоспіні, у паноптично забарвлених мазках за
Мей-Грюнвальд-Гімза). Для типування цитоморфологічного підваріанту
користувались критеріями за FAB-класифікацією. Проводились наступні цитохімічні
реакції:
на мієлопероксидазу методом Льоель, що полягає в окисленні бензидину системою
“перикис водню–пероксидаза” з утворенням забарвленого продукту реакції.
Клітини, які виявляють пероксидазну активність, у своїй цитоплазмі містять
жовто-коричневу зернистість. Проводили підрахунок відсотка позитивних клітин,
оцінюючи при цьому характер та інтенсивність реакції. У всіх хворих реакція на
мієлопероксидазу була від’ємною;
на ліпіди методом забарвлення суданом чорним В за Аккерман, який базується на
здатності діазібарвника (судан чорний В) розчинятися в жирах. Ліпіди
виявляються у вигляді чорних гранул у цитоплазмі клітин. Оцінювалась наявність
чи відсутність продукту реакції в бластних клітинах;
на полісахариди за допомогою PAS-реакції за Мак Манус. Забарвлений в
пурпурово-червоний колір продукт реакції виникає в результаті взаємодії
реактиву Шіффа (у його складі – основний фуксин, соляна кислота та
метабісульфіт натрію) з діальдегідом (утворюється при розриві С-С зв’язків у
структурах, що містять дві суміжні гліколеві групи в положенні 1,2 (СНОН-СНОН),
які окислюються під впливом перйодної кислоти). Оцінювали наявність та характер
розподілу PAS-речовини (дифузний, дрібнозернистий на дифузному фоні, зернистий,
гранулярний);
на неспецифічну естеразу (НЕ) методом азосполучення з використанням субстрату
б-нафтилацетату натрію. Принцип реакції полягає у гідролізі НЕ аліфатичних
ефірів з відносно коротким ланцюгом. Як інгібітор активності ферменту
застосовували фторид натрію у кон­центрації 1,5 мг/1мл субстратної суміші. При
використанні барвника Фаст Блю B активність НЕ маніфестує наявністю темної
зернис­тості з тенденцією до злиття у міру наростання активності ферменту.
Інтенсивність реакції оцінювали насту­пним чином: низька – незначна кількість
зерен у цитоплазмі клітин; помірна – рясна цитоплазматична зернистість; висока
– дифузне заповнення клітин зернистістю, яка покриває і її ядро. Реакцію на НЕ
вважали чутливою до дії інгібітора NaF у випадку повного зникнення активності
ферменту або ж зниження ступеня активності з високого до низького з підрахунком
відсотка клітин, НЕ у яких була чутливою до NaF;
кислу фосфатазу (КФ) методом азосполучення з використанням субстрату
нафтол-AS-BI-фосфат або нафтол-AS-MX-фосфат, розведений у 0,5 мл ацетону, 10 мг
та 0,05 М ацетатного буферу рН 5,6, 25 мг. Активність КФ виявляється у вигляді
гомогенного забарвлення або дрібних гранул червоного кольору у цитоплазмі
клітин. У Т-лімфобластах спостерігається забарвлення у вигляді великих гранул
або плями в одній ділянці цитоплазми.
Імунофенотипові дослідження проведені методом проточної цитометрії з
використанням МКАТ (Becton Dickinson, США i Dako, Данія), кон’югованих з
флюорохромами флюоресцеїн-ізотіоціанатом (FITC) або фікоеритрином (PE). Панель
МКАТ включала 18 типів, направлених до різних кластерів диферен­ціації (CD):
лінійно-незалежні – CD34, HLA-DR, CD38, CD10; B-лінійні – CD19, CD20, CD22;
Т-лінійні – CD1, CD2, CD3, CD4, CD5 [1 Є маркером Т-клітин, також субпопуляції
В Іа], CD7, CD8; мієлоїдні – CD13, CD14, CD15, CD33. Маркування клітин МКАТ і
аналіз результатів на апараті FACScan (Becton Dickinson, США) прово­дили
відповідно до рекомендацій фірми-виробника з калібруванням проточного цитометра
CaliBRITE