РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
2.1 Об'єкти досліджень та реактиви
Дослідження були проведені на щурах-самцях, масою 180-200г, яких утримували на стандартному раціоні віварію. Щурів забивали шляхом декапітації. Об'єктом досліджень був відділ тонкої кишки (порожня кишка).
В дослідах використані наступні реактиви: набори реактивів для визначення загального холестеролу, триацилгліцеролів, загальних ліпідів; аміак, льодова оцтова кислота, хлороформ, етанол, діетиловий ефір, метанол, пентан, гептан, бензиламін, семікарбозид, HClO4, H2SO4, пероксид водню, ферриціанід калію, сукцинат, 2,4-динітрофенол, дитіотриетол, натрій оцтовокислий, аскорбінова кислота, амоній молібденовокислий, боргідрид натрію, NaCl, KCl, MgCl2, Na2HPO4, NaH2PO4, KH2PO4, K2HPO4, тріс-HCl, NaOH, Na2CО3, CuSO4•5H2O, KNaC4H4O6•4H2O, FeCl3, сахароза, ЕДТА, ЕГТА, ДС - Na, NaN3.
Використовували реактиви та органічні розчинники кваліфікації х.ч. або ч.д.а. та зарубіжного виробництва: АТФ, АДФ, AMФ, ротенон, цитохром с, антиміцин А, олігоміцин, убіхінол (CoQ2H2), бичачий альбумін, НАД•Н.
Для приготування водних розчинів застосували бідистильовану воду, ії очищення від органічних домішок здійснювали за допомогою повторної перегонки в присутності КМnО4 і концентрованого розчину Н2SO4 .
2.2. Умови опромінення об'єктів дослідження
Тварини опромінювали на установці РУМ-17 рентгенівськими променями в дозі 0,1, 0,5 та 1,0 Гр за таких умов: потужність дози 0,055 Гр/хв, фільтр 0,5 мм Cu та 1 мм Al, сила струму 5 мА, напруга 200 кВ, шкірно-фокусна відстань - 100 см. Тварин декапітували через 1, 12 та 24год після опромінення.
Дози 0,1, 0,5 та 1,0 Гр ми обрали тому, що за даними літератури можна зробити висновки, що після опромінення в дозі 0,1 Гр спостерігали високий рівень проліферації, а процес апоптозу не проходить або визначається на низькому рівні [20; 21; 22; 23]. За опромінення в дозі 1,0 Грвідмічений високий рівень апоптозу з низькою активністю процесів проліферації. Тоді як за опромінення в дозі 0,5 Гр дані процеси мають перебувати на середньому рівні. Час після опромінення обирали виходячи з попередніх досліджень в нашій лабораторії та літературних даних. Через 1 год після опромінення може ще не ввімкнутися процеси антиоксидантного захисту. Через 12 год спостерігаються стабільні радіаційно індуковані структурно-функціональні порушення. Включаються захисні механізми, такі як репарація, антиоксидантний захист (спостерігається дуже висока активність супероксиддисмутази), відбувається накопичення вільних радикалів, продуктів ПОЛ. Через 24 год після опромінення спостерігаються віддалені наслідки дії радіації. В цей час ентероцити слизової оболонки тонкої кишки, які були опромінені, ще не злущилися. Повна заміна ентероцитів слизової тонкої кишки відбувається на 3-5 день.
Експериментальні тварини були розділені на групи відповідно до умов дослідження:
1-а група - контрольна;
2-а - опромінювали в дозі 0,1 Гр,
а) тварин декапітували через 1 год після дії іонізуючої радіації;
б) тварин декапітували через 12 год після дії іонізуючої радіації;
в) тварин декапітували через 24 год після дії іонізуючої радіації;
3-а - опромінювали в дозі 0,5 Гр,
а) тварин декапітували через 1 год після дії іонізуючої радіації;
б) тварин декапітували через 12 год після дії іонізуючої радіації;
в) тварин декапітували через 24 год після дії іонізуючої радіації;
4-а - опромінювали в дозі 1,0 Гр,
а) тварин декапітували через 1 год після дії іонізуючої радіації;
б) тварин декапітували через 12 год після дії іонізуючої радіації;
в) тварин декапітували через 24 год після дії іонізуючої радіації.
2.3. Виділення мітохондрій та субмітохондріальних частинок клітин слизової оболонки тонкої кишки
Роботу з мітохондріями слизової оболонки тонкої кишки утруднює слиз, нестабільність їх біохімічних показників при зберіганні, а також агресивність внутрішньоклітинного середовища у відношенні окисного фосфорилювання. Щоб уникнути цього необхідно поєднати методичні підходи виділення мітохондрій із слизової оболонки кишки з комплексом умов, які розроблені для інших тканин. В цей комплекс входить забезпечення фізіологічного стану як у внутрішньому середовищі клітин, м'яких умов виділення мітохондрій, невеликий обмежений час роботи з виділеними мітохондріями.
Отримання мітохондрій ентероцитів слизової оболонки тонкої кишки проводили згідно до методу [47] з деякими модифікаціями.
Після декапітації тварини, розтинали її черевну порожнину і відтинали відрізок тонкої кишки (порожню кишку), відділяючи 12см дванадцятипалої кишки. В подальшому виділення проводили використовуючи попередньо охолоджені реактиви, посуд та інструменти. Брали 4 відрізка кишки завдовжки 8-10см, на кінець частини тонкої кишки накладали лігатуру і вивертали кишку, натягуючи її на робочий стержень. Після цього вивернуту кишку промивали в охолодженому (40С) розчині 0,9 % хлориду натрію для відокремлення хімусу та слизу. Кишку знімали з робочого стержня, розрізали на 4 невеликі (2-3 см) шматочки. Ці відрізки поміщали в 50 мл середовища виділення І (250 мМ сахарозу, 3 мМ ЕДТА, 20 мМ тріс-HCl (рН 7,4 при 4оС)). Далі здійснювали м'яку гомогенізацію в гомогенізаторі Поттера-Ельвегейма з тефлоновим товкачем для отримання фракції слизової оболонки. Залишки кишки відкидали, а отриманий гомогенат гомогенізували на ножовому гомогенізаторі "Біомікс" 2500 об/хв протягом 25 с.
Після центрифугування на холоду при 1500g 15 хв надосадкову рідину фільтрували через 3 шари марлі і центрифугували при 11000g 20 хв для осадження мітохондрій.
Супернатант обережно зливали, а отриманий осад ресуспендували в середовищі виділення ІІ (250 мМ сахароза, 30 мМ тріс-НСІ (рН 7,4 при 4оС) в невеликому об'ємі (близько 3 мл), обережно невеликими порціями доводили об'єм до 30 мл. Далі проводили центрифугування при 11000g 20 хв. Отриманий осад обережно ресуспендували в 2 мл середовища II.
Суспензію мітохондрій вико