РОЗДІЛ 2
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Дослідження проводили в період 2001-2007 років у Державному науково-контрольному інституті біотехнології і штамів мікроорганізмів, лабораторії біохімії ННЦ "Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини", Сумській і Херсонській державних біологічних фабриках, тваринницьких господарствах різної форми власності Київської, Донецької, Чернігівської, Сумської, Луганської, Харківської, Черкаської, Хмельницької областей та АР Крим.
Методологічною основою визначення напрямку досліджень були літературні відомості щодо виявлення гриба-дерматофіта Trichophyton mentagrophytes як етіологічного чинника трихофітії великої рогатої худоби, а також даних, які ми отримали під час мікологічного дослідження патологічного матеріалу від хворих на трихофітію тварин.
2.1 Поживні середовища
Для виділення культур дерматофітів, вивчення їхніх культуральних, морфологічних, біохімічних властивостей а також для культивування штамів дерматофітів використовували такі поживні середовища: агар Сабуро, бульйон Сабуро, модифікований агар Сабуро (дріжджовий агар), сусло-агар, а також селективні середовища для виділення дерматофітів з контамінованих проб патологічного матеріалу - агар Сабуро з добавками хлорамфеніколу, гентаміцину, хлортетрацикліну, актидіону. Виготовлення поживних середовищ здійснювали згідно із загальноприйнятими методиками [71, 89, 100], а також використовували готові селективні середовища імпортного виробництва (фірми Hi-Media).
Для довготривалого збереження штамів дерматофітів використовували ліофільно висушені культури. Підготовку культур до висушування здійснювали як за загальноприйнятими методиками [107, 110, 111], так і за методом, запропонованим нами. Культури дерматофітів вирощували на пробірках зі скошеним сусло-агаром упродовж 20-25 діб. Потім у пробірки додавали по 3-5 см3 стерильного фізіологічного розчину кухонної солі й змивали спори. Доводили концентрацію мікроконідій до 400 млн у см3. Суспензію спор дерматофітів асептично змішували в рівних об'ємах із захисним середовищем і фасували по 1 см3 у стерильні пеніцилінові флакони. Як захисні середовища використовували цукрозо-желатинові та цукрозо-желатинові з добавками мікро- і макроелементів.
У дослідах ми використовували сублімаційний апарат LP3 фірми Jouan., в якому після глибокого заморожування за мінус 64 0С упродовж 24 годин здійснюється ліофілізація мікроконідій дерматофітів. Залишкова вологість у висушеній масі становила 2-3 %. Наявність вакууму у флаконах перевіряли за допомогою апарату типу Д'арсанваль. Ліофільно висушені штами дерматофітів зберігали за температури 2-4 0С.
2.2. Матеріал для дослідження
Матеріал для дослідження відбирали від великої рогатої худоби з ураженнями шкіри, схожими на такі при захворюванні на трихофітію, в тваринницьких господарствах різної форми власності Київської, Чернігівської, Сумської, Луганської, Харківської, Хмельницької, Донецької, Черкаської, областей та АР Крим. Всього було досліджено 293 зразки матеріалу.
Матеріалом для дослідження було уражене волосся, кірочки та лусочки шкіри. Відібраний матеріал спочатку піддавали мікроскопії. Матеріал розміщували в чашці Петрі, за допомогою очних ножиць, пінцету та препарувальної голки відбирали потовщені кореневі частини волосків, лусочок шкіри, які розміщували на предметному склі. На розміщений матеріал додавали краплю 10 % розчину їдкого натру та злегка підігрівали над полум'ям до появи білого ореолу на краях краплі. Потім додавали 50 % водний розчин гліцерину й накривали покрівним скельцем. Мікроскопію здійснювали в світловому мікроскопі під збільшенням х100, х200, х400.
2.3. Штами дерматофітів
У роботі використовували культури грибів-дерматофітів, виділених з патологічного матеріалу від хворих телят тваринницьких господарств різної форми власності Київської, Рівненської, Чернігівської, Сумської, Луганської, Дніпропетровської, Черкаської, Житомирської областей та АР Крим.
2.3.1. Виробничі штами трихофітонів
Для виготовлення вакцини "Триходерм" проти трихофітії великої рогатої худоби бівалентної, живої, сухої, концентрованої - ТУУ 24.4-19024865 -002:2005, а також для контролю активності вакцини використовували штами трихофітонів Trichophyton verrucosum "Княжичі" (Кн-01), С-102, та Trichophyton mentagrophytes "ТМЧ" і Trichophyton mentagrophytes "ТМЧ-К". Наведене нижче описання штамів проводили після інкубації культур на сусло-агарі впродовж 15-20 діб при температурі 26±10 С.
Штам "Княжичі" був виділений від хворого теляти в Київській області. Шляхом цілеспрямованої селекції була знижена його природна патогенність і збережені високі ростові властивості. Штам має такі характеристики: ріст на сусло-агарі проявляється на 5 - 7 доби, колонії плискі, злегка випуклі, зірчасті, порошисті, радіально смугасті, ріст субстратний, ростучий край променистий, білого, злегка кремового кольору. Міцелій септований, гілчастий, багаточисельні мікроконідії грушоподібні, округлі, продовгуваті.
Штами С-102 і С-202 були виділені від хворих телят у Сумській області. Обидва штами патогенні для лабораторних і сільськогосподарських тварин, мають високу вірулентність. Штам С-102 має такі характеристики: ріст на 7 - 15 доби, колонії випуклі, бугристі, округлі, гладкі, бархатисті, радіально смугасті, міцелій субстратний, мають рівний ростучий край. Білого кольору. Міцелій септований, гілчастий, мікроконідії багаточисельні, грушоподібні або округлі. Штам С-202 має такі характеристики: ріст на 3 - 5 доби, колонії випуклі, бархатисті, бархатисто-пухнасті, ватоподібні, радіально смугасті, міцелій швидко розростається по живильному середовищу, вкриває всю поверхню, променистий ростучий край. Білого кольору. Міцелій септований, гілчастий, мікроконідії багаточисельні грушоподібні, округлі, продовгуваті.
Штам "ТМЧ" має такі характеристики: ріст на 3-4 доби, колонії плискі, порошисто - мучнисті,