Технология изготовления белково-целлюлозных комплексов из микобактерий и их иммуногенные свойства

2
ОГЛАВЛЕНИЕ
стр.
ВВЕДЕНИЕ............................................................ 4
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ................................................. 8
1.1. Микобактерии и их свойства..................................... 8
1.2. Химическая структура микобактерий туберкулеза................. 10
1.2.1. Белки микобактерий........................................... 11
1.2.2. Полисахариды микобактерий................................... 14
1.2.3. Липиды микобактерий......................................... 17
1.3. Строение клетки микобактерий................................... 23
1.3.1. Клеточные оболочки микобактерий.............................. 23
1.3.2. Цитоплазма микобактерий...................................... 25
1.3.3. Рибосомы микобактерий........................................ 26
1.4. Механизм иммунного ответа при туберкулезе...................... 28
1.4.1. Гиперчувствительность замедленного типа
в противотуберкулезном иммунитете.............................. 30
1.5. Вакцины из убитых микобактерий и иммуногенные фракции 34
1.6. Заключение к обзору литературы................................. 36
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ......................................... 38
2.1. Материалы и методы исследования................................ 38
2.2. Приготовление суспензии целлюлозы из хлопковой ваты............ 40
2.2.1. Получение неактивированной целлюлозы......................... 41
2.2.2. Получение целлюлозы, активированной путем окисления перйодатом натрия........................................... 42
2.2.2.1. Определение окисленных альдегидных групп
в окисленной целлюлозе....................................... 42
2.3. Использование ПГ1Д-туберкулина в качестве антигена,
иммобилизованного на целлюлозе.................................. 43
3
2.3.1. Присоединение белка к частичкам окисленной суспензии целлюлозы.................................................. 44
2.3.2. Присоединение белка к частичкам суспензии неактивированной целлюлозы.................................................. 45
2.4. Изучение иммуногенных и протективных свойств белково-целлюлозных комплексов из ППД-туберкулина
на белых мышах............................................ 46
2.4.1. Изучение иммуногенных свойств конъюгатов с использованием мышей линий ВАЬВ/с и С57ВЕ/6............................... 46
2.4.2. Иммуногенные и протективные свойства конъюгатов,
изученные на мышах линии СВА............................. 50
2.5. Белково-целлюлозные комплексы из антигенов, выделенных
из разрушенной культуры БЦЖ............................... 53
2.5.1. Технология выделения антигенов из культуры БЦЖ......... 53
2.5.2. Иммобилизация антигенов, выделенных из разрушенной
культуры БЦЖ на целлюлозной матрице...................... 55
2.5.3. Изучение протективных свойств полученных препаратов
на морских свинках....................................... 56
2.5.3.1. Патологоанатомическая картина у морских свинок....... 57
2.6. Изучение иммуногенных свойств туберкулезной бесклеточной вакцины (ТБЦ) на молодняке крупного рогатого скота......... 80
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ........................ 102
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................. 110
5. ВЫВОДЫ...................................................... 112
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ................................... 114
ЛИТЕРАТУРА..................................................... 115
ПРИЛОЖЕНИЕ..................................................... 138
14
большую роль в иммунодиагностике туберкулеза. Туберкулопротеиды являются полными антигенами. Они вызывают образование антител в сыворотках крови экспериментальных животных, являются активными и специфическими антигенами в серологических реакциях. О протективных свойствах тубер-кулопротеидов имеются лишь единичные работы. Наиболее вероятно, что белки микобактерий туберкулеза не обладают самостоятельно выраженным протективным действием.
1.2.2. Полисахариды микобактерий
По данным F.B. Seibert, E.F. Miller, U. Buscman (1956) на долю полисахаридов приходится до 15% сухой массы микобактерий туберкулеза. Полисахариды находятся в микобактериальной клетке, как в свободном, так и в связанном состоянии с белками, нуклеиновыми кислотами, фосфатидами и восками. Полисахариды микобактерий представлены высшими сахаридами -олигозидами, полиозидами (мукополисахариды) и нейтральными олигопо-лиозидами. Авторы выделили из фильтрата культуры микобактерий полисахарид I и полисахарид II.
R. Kaiser (1969) получил из фильтрата культуры М. humanus полисахаридную фракцию, состоящую из полиглюкозана и трех азотсодержащих полисахаридов, характеризующихся иммуногенностью для экспериментальных животных. Полисахариды, выделенные из микобактерий и фильтрата культур, различаются по химическому составу, однако все они, как правило, содержат полисахарид I, идентифицированный F.B. Seibert, глюкозу и арабино-зу.
J. Azuma, Y. Yamamura et al. (1969) выделили из М. ауоша и 4 штаммов других микобактерий, а также из фильтрата культур микобактерий 4 полисахарида: глукан, маннан, арабиноманнан и арабиногалактан. Арабиног&такта-
15
ны сосредоточены б основном в оболочках клеток микобактерий в комплексе миколовая кислота-арабиногалактан-мукопептиды. Арабиногалактаны всех исследованных штаммов имели одинаковое химическое строение. Арабино-маннан содержится в основном в цитоплазме микобактерий. В иммуноэлектрофорезе арабиноманнаны и арабиногалактаны формировали одиночные дуги преципитации с одинаковой электрофоретической подвижностью. Обе фракции микобактериальных полисахаридов характеризовались высокой активностью в реакциях с гомологичными и гетерологичными антисыворотками, а также с антисыворотками против С. diphtheria и N. asteroides.
В то же время применение арабиногалактана и арабиноманнана не вызывало кожной реакции ГЗТ (даже при введении в дозе 100 мг) ни у сенсибилизированных животных, ни у больных людей. У сенсибилизированных животных эти полисахариды индуцировали кожные реакции типа Артюса или приводили к развитию анафилактического шока при их внутривенном введении. Они не подавляли in vitro миграцию клеток перитонеального экссудата от сенсибилизированных морских свинок. Глукан и маннан были неактивными во всех иммунологических реакциях.
Введение свободных полисахаридов микобактерий в здоровый организм не вызывало патологической реакции. Туберкулополисахариды, выделенные из гликолипопротеидных комплексов, как правило, усиливали деятельность гемопоэтической системы костного мозга и вызывали в месте введения скопление большого количества клеток, в основном нейтрофилов. Введение больших доз полисахаридов или в смеси с неполным адъювантом Фрейнда приводило к сенсибилизации организма экспериментальных животных. Это выражалось в развитии анафилактоидных реакций вплоть до анафилактического шока при повторном внутривенном введении полисахаридов и в кожных реакциях типа Артюса (М.М. Авербах с соавт., 1976).
Большинство исследователей указывают, что туберкулополисахариды не могут вызывать кожные реакции ГЗТ. Тем не менее S.D. Chaparas et al.